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目的：内皮功能障碍尤其是内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)功能障碍参与动脉粥样硬化的发生发展,研究发现外周血一氧化氮(nitric oxide, NO)浓度与循环EPCs水平呈明显正相关,提示NO与循环EPCs功能具有密切的联系。鉴于硝酸甘油能通过提供外源性NO来模拟内源性NO释放系统的作用以及NO与EPCs增殖的密切关系,硝酸甘油极有可能促进冠心病患者EPCs的增殖,拥有扩血管作用之外的心血管保护作用,尽管有硝酸甘油过量耐药引起EPCs增殖和功能障碍的报道,但硝酸甘油在临床常用的非耐药情况下对EPCs增殖的影响无疑也具有重要的临床意义,对此目前缺乏系统的研究。此外,硝酸甘油非中毒浓度范围内对EPCs增殖的影响机制、过量耐药产生的机制和对抗耐药的方法等问题,国内外未见有系统的研究报道。本研究体外培养冠心病患者外周血EPCs,观察不同浓度硝酸甘油刺激后,冠心病患者外周血EPCs体外增殖的变化,探索硝酸甘油对EPCs体外增殖的影响及其与药物浓度的关系,在此基础上进行进一步实验,探讨硝酸甘油在典型药物浓度时对EPCs体外增殖影响的相关分子机制以及硝酸甘油耐药的干预措施,以期为硝酸甘油在冠心病治疗中的使用提供新的基础理论依据,探讨其在适宜浓度下成为促EPCs增殖药物的可行性,并为解决硝酸甘油耐药问题提供新的思路。方法：1.取正常健康志愿者的外周血20m1/例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,并将其接种在人纤维连接蛋白包被的6孔细胞培养板中,用加入血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、链霉素、青霉素及胎牛血清的M199培养液培养细胞,7天后收集贴壁细胞,通过细胞形态观察及DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素对贴壁细胞进行双荧光染色鉴定,双染色阳性的细胞为正在分化的EPCs,并将贴壁细胞重新接种后用MTT法描绘细胞生长曲线。2.经冠状动脉造影等资料确诊为冠心病的患者60例,取外周血20m1/例,培养7天后收集贴壁细胞重新接种,选择采用不同浓度的硝酸甘油0.0 mg/L(对照组)、0.3mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、7.5mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L,对冠心病患者EPCs体外培养进行干预,并用MTT法及人工计数法检测细胞增殖能力,同时检测细胞培养上清液中的NO、人血管内皮生长因子A和过氧化亚硝基阴离子的产生水平,观察硝酸甘油对冠心病患者外周血EPCs的增殖能力的影响。3.观察在硝酸甘油典型药物浓度7.5mg/L及20.0mg/L的基础上联用磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositide-3-kinase,PI3K)抑制剂LY294002(在硝酸甘油干预前12小时用LY294002提前干预)对冠心病患者外周血EPCs体外增殖的影响,并检测细胞培养上清液中的NO、人血管内皮生长因子A和贴壁细胞活性氧的产生水平,并用Western blotting检测贴壁细胞的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine-threonone protein kinase,Akt) (Ser473)、磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phospho-serine-threonone protein kinase,P-Akt) (Ser473)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthetase,eNOS) (Ser1177)和磷酸化内皮型一氧化氮合酶(phospho-endothelial nitric oxide synthetase,P-eNOS) (Ser1177)的表达,以初步探索硝酸甘油影响EPCs增殖的机制。4.在硝酸甘油中毒浓度20.0mg/L基础上联用p-巯基乙醇(在硝酸甘油干预前4小时先用p-巯基乙醇干预),复测EPCs增殖能力,活性氧的产生及贴壁细胞Akt (Ser473)、P-Akt (Ser473)、eNOS (Ser1177)和P-eNOS (Ser1177)的表达,探讨β-巯基乙醇对硝酸甘油耐药的影响及其潜在机制。所有实验至少重复4次,计量资料以均数±标准差表示,应用SPSS16.0软件进行统计学处理,采用单因素方差分析比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.倒置相差显微镜下细胞形态学特征：培养24小时后单个核细胞开始贴壁,培养7天的EPCs,可见细胞克隆周围出现梭形细胞(图1A)；培养14天的EPCs,可见呈大的集落样生长,四周梭形细胞放射状排列(图1B)；再多培养1-2天呈铺路石样改变(图1C)。用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素鉴定EPCs吸附FITC标记的荆豆凝集素呈绿色(×100)(图1D),EPCs吸附DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白呈红色(×100)(图1E),同时吸附二者呈黄色(x100)(图1F)；外周血EPCs的生长曲线：将分离得到的单个核细胞培养7天后,将贴壁细胞按2×105/ml重悬接种在96孔板中,用MTT检测细胞的增殖能力。可见细胞增殖开始有明显的上升趋势,从第1天到第5天(相当于第8-12天)细胞的吸光度值表现为逐渐增加趋势,尤其到第7天(相当于第14天)的EPCs增殖能力明显增强(图2)。2.本研究发现硝酸甘油在7.5 mg/L促外周血EPCs增殖达峰值,但增加硝酸甘油浓度至20.0mg/L出现明显抑制增殖效应(图3)；培养上清液NO含量随硝酸甘油浓度增加呈现浓度梯度现象(图4)；上清液过氧化亚硝基阴离子含量及贴壁细胞活性氧在硝酸甘油浓度<7.5mg/L的范围内增加不明显,浓度20.0mg/L时明显高于对照组(图4和图5)；上清液血管内皮生长因子A含量在硝酸甘油浓度7.5 mg/L时达峰值,之后下降(图4A)；7.5 mg/L硝酸甘油增强EPCs p-eNOS (Ser1177)、p-Akt (Ser473)的表达,20.0mg/L时抑制其表达,上述药物均对eNOS (Ser1177)、Akt (Ser473)的表达无明显作用(图6)。说明硝酸甘油在适量浓度释放适量NO但细胞活性氧(主要是过氧化亚硝基阴离子)产生未过量,此时NO的生物利用度高,提高eNOS、Akt的磷酸化水平,细胞血管内皮生长因子A分泌增加,EPCs增殖活跃,而过高浓度硝酸甘油释放过量NO,细胞活性氧产生过多,NO生物利用度降低,抑制eNOS、Akt的磷酸化,血管内皮生长因子A分泌减少,EPCs增殖能力下降。3.p-巯基乙醇能改善20.0mg/L硝酸甘油对EPCs增殖的抑制作用,降低高浓度硝酸甘油引起的贴壁细胞内活性氧产生,并改善p-eNOS (Ser1177)、p-Akt(Ser473)的表达,但对Akt、eNOS的表达无作用。(见图5,7)结论：1.硝酸甘油对EPCs体外增殖的影响与浓度具有密切的关系,在适宜浓度下对EPCs增殖具有促进作用,过高浓度下其作用趋向抑制。2.适量浓度的硝酸甘油提供的外源性NO通过激活PI3K/Akt信号通路促进血管内皮生长因子A的分泌来促进EPCs增殖作用,高浓度硝酸甘油提供的过量外源性NO使过氧化亚硝基阴离子和活性氧显著增加,损伤细胞酶系统,产生硝酸甘油耐药,抑制p-eNOS,p-Akt表达,使血管内皮生长因子A生成减少,抑制EPCs增殖。3.p-巯基乙醇可通过减轻EPCs的氧化应激和改善PI3K/Akt-eNOS信号通路来逆转硝酸甘油耐药。