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目的:鉴定目的基因骨形态蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)的DNA序列;检测BMP7基因在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达;研究BMP7蛋白在BMSCs向软骨细胞分化过程中的作用。
方法:脂质体介导重组pcDNA3.1-BMP7质粒转染体外培养的兔BMSCs,转染后7天、21天,收集用G418筛选和未筛选的BMSCs,提取总RNA,进行PCR扩增和DNA测序分析;收集同样处理的BMSCs培养上清液,用Western Blot方法检测分泌至上清中的BMP7蛋白;取转染后不同时间的BMSCs,经阿尔新蓝染色,倒置显微镜下观察细胞生长状态:同时,应用ELISA法检测细胞培养上清液中II型胶原蛋白的浓度。
结果:BMP7的DNA序列全长约为1.3Kb,其DNA序列与Gene Bank报道的一致,无突变发生。转染后用G418筛选,细胞大量死亡。转染后筛选21天仍有阳性克隆细胞,且阳性克隆细胞表达了BMP7 mRNA和BMP7蛋白。未筛选组也得到同样的结果,但BMP7的表达较筛选组少。阿尔新蓝染色显示转染未筛选组和诱导液组的BMSCs具有软骨细胞的特性。转染未筛选组和诱导组BMSCs培养7天、14天、21天培养液中II型胶原蛋白含量与空白组比较均有明显提高(P<0.05),两组之间比较无明显差异(P>0.05)。
结论:在脂质体的介导下将pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒转染入BMSCs。转染未筛选组表达了BMP7活性蛋白,该活性蛋白能够诱导BMSCs向软骨细胞方向分化,其诱导能力接近诱导剂(TGF-β1加地塞米松)的水平。本研究为今后进一步构建BMP7基因组织工程软骨及其他的转基因组织工程研究奠定了基础。