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mTOR(mammalian target of rapamycn)信号通路是一条调节蛋白质合成、细胞生长、增殖等的信号通路。以往研究表明,mTOR信号通路参与了红藻氨酸(Kainic Acid,KA)诱导的大鼠癫痫的发生,并导致一系列癫痫后病理变化。雷帕霉素(Rapamycin)是mTOR信号通路特异性抑制剂,能够抑制mTOR信号通路的异常激活,并改善癫痫后病理变化以及减少自发性癫痫的产生,从而发挥潜在的抗癫痫作用。因此,在我们的研究中,我们探讨了雷帕霉素给药在正常SD大鼠以及KA诱发癫痫模型大鼠中对mTOR信号通路的作用。同时,构建条件性敲除神经前体细胞Rptor基因的小鼠,探讨敲除雷帕霉素作用靶点Raptor蛋白后对癫痫及并发症的影响,以明确mTOR信号通路在癫痫调控中的作用。第一章雷帕霉素对mTOR信号通路的矛盾性作用目的:前期研究发现,在KA诱导癫痫模型中提前较短时间给予雷帕霉素,更严重地激活以S6蛋白磷酸化为检测指标的mTOR信号通路,这与雷帕霉素对mTOR信号通路的抑制性作用相矛盾。因此,本研究拟在正常SD大鼠及KA诱导的SD大鼠癫痫模型中对雷帕霉素的矛盾性作用进行更详细的研究,明确雷帕霉素对mTOR信号通路及癫痫的作用。方法::在正常SD大鼠中给予单次不同剂量(0.3,1,3,1Omg/kg)的雷帕霉素以及给予单次单一剂量雷帕霉素(3mg/kg)作用不同时间点(1,3,6,15,24h),以确定雷帕霉素的量效与时效关系。同时,在KA诱导急性癫痫发作前,不同时间(1,3,6,15,24h)给予雷帕霉素以及雷帕霉素给药后急性癫痫发作不同时间(1,3,6,15,24h),检测S6蛋白磷酸化,以探讨雷帕霉素对癫痫mTOR信号通路的作用。另外,监测雷帕霉素不同时间(1,10h)给药后癫痫症状以及癫痫后神经细胞死亡,探讨雷帕霉素矛盾性作用的影响。最后,检测mTOR信号通路中Akt,Raptor,Rictor,S6k,S6蛋白磷酸化,以及给予Akt抑制剂哌立福辛(Perifosine),探讨雷帕霉素矛盾性作用的可能机制。结果:1.在正常SD大鼠中,提前3-24小时给予雷帕霉素能够抑制S6蛋白磷酸化,并呈剂量依赖性,而提前1小时给予雷帕霉素反而矛盾性增加了 S6蛋白磷酸。2.在KA诱导的急性癫痫模型中,提前10小时给予雷帕霉素,能够抑制癫痫导致mTOR信号通路的激活,而提前1-6小时给予雷帕霉素,反而矛盾性加重了癫痫导致mTOR信号通路的激活。3.提前1小时给予雷帕霉素,加重了癫痫的严重程度、癫痫持续时间及神经细胞死亡,而提前10小时给予雷帕霉素,对癫痫症状没有影响,但是可以减少神经元死亡。4.雷帕霉素对S6蛋白磷酸化的矛盾性作用与上游mTOR信号通路相关,并且,提前给予Akt抑制剂哌立福辛能够逆转雷帕霉素对S6磷酸化的矛盾性作用。结论:短时间给予雷帕霉素诱导了 S6蛋白激活,废除了雷帕霉素的抗癫痫作用。雷帕霉素对mTOR通路的调节具有高度复杂性,其原因可能与上游信号通路相关。第二章选择性敲除神经前体细胞中Rptor基因敲除对mTOR信号通路的作用目的:Raptor蛋白是mTOR信号通路中mTOR激酶调节相关蛋白,由Rptor基因编码。前期研究提示我们mTOR信号通路在癫痫发生中具有重要作用。为了探讨Raptor蛋白在癫痫及癫痫导致的相关疾病中的作用,我们制备在神经前体细胞中敲除Rptor的条件性敲除小鼠,以明确Raptor蛋白的作用。方法:构建条件性敲除神经前体细胞Rptor基因小鼠,对基因敲除小鼠外观及发育进行观察。同时,观察在正常情况及红藻氨酸(Kainic acid,KA)致痫后,基因敲除小鼠mTOR信号通路的改变及癫痫状态。FJB染色和TIMM染色分别观察KA致痫后基因敲除小鼠脑神经细胞死亡情况和苔藓纤维发芽情况,并EEG记录致痫后基因敲除小鼠自发性癫痫频率。最后,水迷宫实验,旷场实验和兴奋性实验观察小鼠行为学变化。结果:1.Rptor基因敲除小鼠(Rptor CKO mice)在外观与对照小鼠没有区别,并且Rptor基因敲除后,mTORC1信号通路被抑制。2.Rptor基因敲除小鼠脑重及体重比对照小鼠低,并且大脑上皮层神经元厚度减少。3.KA诱导癫痫后,KA导致的mTOR信号通路过度激活得到抑制,但Rptor基因敲除小鼠癫痫状态与对照小鼠没有明显差异。4.在Rptor基因敲除小鼠中,存在极少次数的自发性癫痫,且癫痫导致的苔藓纤维发芽得到改善。5.Rptor基因敲除小鼠在一定程度能够减少KA导致的认知障碍,减少焦虑行为及过度兴奋性。结论:尽管在神经前体细胞细胞中敲除了Rpto 基因后使小鼠早期发育受到影响,但在癫痫并发症及癫痫后行为中都得到一定改善。同时,也提示我们Raptor蛋白在癫痫及mTOR信号通路中有非常重要的作用。