研究背景高血压是心血管疾病及其靶器官损害的可干预的风险因素。全球每年有约760万人因高血压致死,有9200万人因高血压致残。但高血压的发病机制尚不完全清楚。现在的研究认为:组织器官间的不良对话参与高血压的发病。脂肪组织不单是一个能量储存器官,也是机体一个重要的内分泌器官。脂肪组织分泌产生多种细胞因子,包括脂联素、瘦素、抵抗素、白介素6等,其中血中脂联素（Adiponectin,Adn）的含量在高血压病人中显著下降,且与高血压病人血压升高程度呈显著负相关。脂联素敲除小鼠(Adn^-/-)在高盐饮食诱导的情况下发生高血压,伴有血管组织内皮一氧化氮合成酶的表达显著降低;而高血压动物模型KKAy小鼠和SHR（Spontaneously hypertensive rats）大鼠在给予脂联素治疗后可以显著降低其血压。以上研究提示:脂联素在高血压中具有重要的调节作用。肾脏在调节钠盐代谢平衡中具有重要作用,异常的尿钠排泄参与了高血压的发生、发展。血中脂联素减少的高血压患者,会伴有受损的尿钠排泄;高血压动物模型SHR大鼠血浆脂联素含量也是降低的,同样伴有显著的尿钠排泄障碍。脂联素作为脂肪组织和肾脏间的一个信号分子,在肾脏尿钠代谢中的作用尚不完全清楚。我们推测:在正常生理状态下脂联素促进尿钠排泄,脂联素诱导的促尿钠排泄功能的缺失是高血压发生的重要机制。于是我们构建了脂联素敲除小鼠及其野生型对照小鼠,研究了脂联素敲除小鼠的血压、尿钠排泄等表型,以及它们之间的内在机制。多巴胺受体在促进钠盐排泄调控血压中具有重要作用,多巴胺受体分为两个亚型:D₁类受体,包括D₁受体和D₅受体,D₂类受体,包括D₂受体、D₃受体和D₄受体。其中D₁R的作用尤为突出,D₁R介导尿钠排泄功能损伤或缺失是高血压发生的重要因素。研究发现,除被磷酸化修饰脱敏以外,受体之间协同作用的缺失也是影响D₁R功能的重要方式:CCK_BR（胃泌素受体）和D₁R存在生理共链接,可形成异二聚体,二者协同促进尿钠排泄,CCK_BR和D₁R之间协同作用的缺失可能是D₁R在SHR中功能受损的重要原因之一。在高血压动物模型Zucker大鼠中,既往的研究发现D₁R介导的促尿钠排泄作用是受损的,但引起D₁R功能异常的原因并不完全清楚,这可能跟其降低的脂联素含量及其受损的促尿钠排泄作用有关。脂联素受体1（Adiponectin receptor 1,AdipoR₁）在肾脏处于高表达状态,AdipoR₁很可能是脂联素作为一个潜在的对尿钠排泄具有促进作用的脂肪因子发挥作用的主要途径。由此我们推测,AdipoR₁与D₁R存在生理共链接和协同作用,AdipoR₁与D₁R协同作用的降低很可能是D₁R在Zucker大鼠中功能受损的重要机制。多巴胺D₅受体在肾小管各段均有表达,尤其在肾近曲小管、髓袢升支、远曲小管、集合管表达丰富。相比于其他多巴胺受体,多巴胺D₅受体与多巴胺的亲和力最高,它可以被低浓度内源性激动剂激活,甚至可以自激活。多巴胺D₅受体和其他多巴胺受体亚型一样,通过调节机体钠盐的平衡,对血压调控具有重要作用。DRD5基因敲除小鼠会发生高血压,给予高盐处理后血压升高更多,且其肾脏血管紧张素II的1型受体（AT1R）、钠盐转运体的表达也是增加的,并伴有增加的氧化应激。多巴胺D₅受体可以通过抑制磷脂酶D（PLD）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的表达,和上调血红素加氧酶1（HO-1）的表达来降低活性氧族的产生。人类DRD5基因具有单核苷酸多态性（SNPs）,有些会导致D₅受体的功能降低和与腺苷酸环化酶的偶联程度降低。其中人D₅受体F173L(hD₅R^F173L)突变体刺激cAMP产生能力显著降低。我们前期的研究仅发现,与对照相比,hD₅R^F173L转基因小鼠血压升高,但造成其肾脏D₅受体功能缺陷的机制尚不清楚。我们当前的实验主要从氧化应激和尿钠代谢的角度研究多巴胺D₅受体F173L引起hD₅R^F173L转基因小鼠血压升高的原因。研究目的1.明确Adn^-/-小鼠血压、肥胖、尿钠排泄等表型。2.研究Adn在SHR中促尿钠排泄作用受损的分子机制。3.明确GRK4对AdipoRs磷酸化脱敏调节作用。4.研究AdipoR₁与D₁R协同作用及其机制。5.明确AdipoR₁与D₁R协同在SHR中受损的机制。6.研究hD₅R^F173L转基因小鼠的血压、尿钠排泄等表型。7.明确hD₅R^F173L转基因小鼠尿钠排泄障碍、血压升高的原因。研究内容和方法1、Adn^-/-小鼠血压、尿钠、尿量等表型研究。（1）采用尾套法连续监测Adn^-/-小鼠及其对照WT小鼠血压随月龄的变化情况。（2）利用小鼠代谢笼检测Adn^-/-小鼠及其与对照WT小鼠的尿钠排泄差异。（3）利用电子天平检测Adn^-/-与对照WT小鼠的体重随月龄的变化情况。（4）利用RT-PCR的方法验证Adn^-/-小鼠的基因型。（5）利用Western blot的方法验证Adn^-/-小鼠脂联素蛋白在脂肪组织、血浆、肾脏组织的敲除情况。2、AdipoRs磷酸化水平在WKY和SHR的差异,AdipoRs与G蛋白关系,以及这种关系在WKY和SHR中的差异。（1）利用western blot的方法检测对比Adn、AdipoRs、GRK4在WKY与SHR的异同。（2）采用IP及IB的方法检测AdipoRs在Ser/Thr残基位点上磷酸化水平在WKY与SHR的异同。（3）采用Co-IP的方法检测AdipoRs与Gαq、Gαs、Gαi的共链接情况以及这种共链接作用在WKY与SHR的差异。（4）利用western blot检验Gαi阻断剂PTX（Pertussis toxin）对Adn上调p-AMPK的作用。（5）利用western blot检测对比Adn上调p-AMPK的作用在WKY与SHR的RPT细胞中的差异。（6）利用western blot检测对比Adn上调p-eNOS的作用在WKY与SHR的RPT细胞中的差异。3、GRK4是肾脏中调节AdipoRs磷酸化脱敏的重要激酶。（1）采用IP及IB的方法检测AdipoRs在Ser/Thr残基位点上磷酸化水平在GRK4142V转基因小鼠与WT的异同。（2）采用小鼠静脉灌注的方法检测Adn的促尿钠排泄在GRK4 142V转基因小鼠与WT的差异。（3）采用Co-IP的方法对比分析AdipoRs与Gαi的共链接情况GRK4 142V转基因小鼠与WT的差异。4、AdipoR₁与D₁R协同促进尿钠排泄,AdipoR₁与D₁R的共链接作用降低是它们在SHR中功能受损重要机制。（1）采用小鼠全身灌注的方法检测D₁R敲除后Adn促尿钠排泄作用的变化及Adn敲除后D₁R促尿钠排泄作用的变化。（2）采用Co-IP的方法检测刺激一个受体情况下,AdipoR₁与D₁R共链接作用增强情况,以及其在WKY与SHR的RPT细胞中的差异。（3）利用western blot检测刺激一个受体情况下,AdipoR₁与D₁R中另一个受体膜定位改变情况,以及其在WKY与SHR的RPT细胞中的差异。（4）采用激光共聚焦的方法检测刺激一个受体情况下,AdipoR₁与D₁R在细胞膜共定位变化情况,以及其在WKY与SHR的RPT细胞中的差异。（5）采用Na⁺-K⁺-ATPase方法,检测激活刺激AdipoR₁与D₁R两者中一个受体对另外一个受体功能的促进作用,以及这种作用在WKY与SHR的RPT细胞中的差异。5、hD₅R^F173L转基因小鼠的血压、尿钠排泄等表型研究。（1）采用尾套法连续监测Adn^-/-小鼠及其对照WT小鼠血压随月龄的变化情况。（2）采用麻醉状态下颈动脉插管法直接测量不同月龄hD₅R^F173L转基因小鼠及其对照小鼠血压。（3）采用小鼠静脉灌注的方法检测多巴胺D₁类受体激动剂Fenoldopam的促尿钠排泄作用在hD₅R^F173L转基因小鼠与对照WT的差异。（4）利用小鼠代谢笼检测hD₅R^F173L转基因小鼠及其与对照WT小鼠在不同月龄的尿钠排泄差异。6、抗氧化应激蛋白thioredoxin 1（Trx1）在hD₅R^F173L转基因小鼠尿钠排泄障碍、血压升高的作用。（1）利用Western blot检测对比Trx1在hD₅R^F173L转基因小鼠及其与对照WT小鼠肾脏表达差异。（2）利用Western blot检测验证D₅R通过PLC/PKC对Trx1的上调作用。（3）采用Co-IP的方法检测,D₅R与Gαq、Gαs的偶联程度在D₅RF173L转基因鼠及其与对照WT小鼠之间的差异。（4）采用IP的方法检测D₅R在丝氨酸/苏氨酸两个残基位点的磷酸化水平在hD₅R^F173L转基因小鼠及其与对照WT小鼠之间的差异。（5）利用Western blot对比fenoldopam上调Trx1在hD₅R^F173L转基因小鼠及其与对照WT小鼠原代肾近曲小管上皮细胞间的差异。（6）利用PKC活性检测试剂盒对比fenoldopam上调PKC活性作用在hD₅R^F173L转基因小鼠及其与对照WT小鼠原代肾近曲小管上皮细胞间的差异。实验结果:1、Adn^-/-小鼠在没有给与高盐高脂诱导的情况下,从第5月龄后开始出现血压升高,并伴有24小时尿钠减少、24小时尿量减少、肥胖等表型,其中尿钠排泄从4月龄就已经显著减少。2、利用Western blot的方法可以明确检测到由脂肪合成经血流转运的Adn在肾脏组织大量存在,同时AdipoRs在肾脏表达丰富,尤其是RPT细胞。3、在SHR中,血清Adn含量显著降低,肾脏AdipoRs的表达与WKY没有统计学差异,但是AdipoRs的磷酸化水平,无论是丝氨酸位点还是苏氨酸位点均增高2-3倍。且GRK4的表达在SHR中显著增高。4、AdipoRs与Gαi存在共链接,与Gαq、Gαs几乎不存在链接,Gαi的抑制剂PTX可以阻断Adn在RPT中上调p-AMPK的作用。5、利用siRNA敲低AdipoR₁可以阻断Adn上调RPT细胞p-AMPK的作用。6、在SHR中,AdipoRs与Gαi共链接程度显著减低,Adn上调RPT细胞p-AMPK/p-eNOS的作用显著降低。7、GRK4 142V转基因小鼠肾脏AdipoRs的磷酸化水平显著增高,无论是丝氨酸位点还是苏氨酸位点,其增高幅度与AdipoRs在SHR中基本一致。8、在GRK4 142V转基因小鼠全身灌注实验中,Adn的促尿钠排泄作用与WT小鼠相比明显降低。9、敲除D₁R,Adn的促尿钠排泄作用明显降低;敲除Adn,D₁R激动剂Fen的促尿钠排泄作用显著减弱。10、D₁R与AdipoR₁存在共链接,其共链接程度在SHR中明显降低;刺激一个受体可以明显增强另一个受体与之共链接,但在SHR中缺没有。11、激活D₁R与AdipoR₁中一个可以增加另一受体的膜表达,但在SHR缺没有或是显著受损。12、D₁R与AdipoR₁在细胞膜存在共定位,无论刺激其中哪一个受体均可增强这种共定位作用,在SHR中缺没有。13、与WT对照相比,hD₅R^F173L转基因小鼠血压升高,伴有尿钠排泄障碍。14、灌注实验显示,与WT对照相比,fenoldopam的促尿钠排泄作用在hD₅R^F173L转基因小鼠中是显著降低的。15、D₅R特异性通过PLC/PKC途径上调肾近曲小管上皮Trx1的表达。16、与WT对照小鼠相比,D₅R的在丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化水平在hD₅R^F173L转基因小鼠肾脏中显著升高。17、与WT对照小鼠相比,D₅R与Gαq、Gαs偶联程度在hD₅R^F173L转基因小鼠肾脏中明显下降。18、与WT对照小鼠的原代肾近曲小管上皮细胞相比,fenoldopam上调Trx1的表达的作用在hD₅R^F173L转基因小鼠原代肾近曲小管上皮细胞中是缺失的。19、与WT对照小鼠的原代肾近曲小管上皮细胞相比,fenoldopam上调PKC活性的作用在hD₅R^F173L转基因小鼠原代肾近曲小管上皮细胞中是缺失的。实验结论:1、Adn^-/-小鼠自发出现高血压,并伴有尿钠排泄障碍,提示Adn在促进尿钠排泄调控血压中发挥重要作用。2、脂联素受体与抑制型G蛋白Gαi存在生理偶联,脂联素通过激活肾脏AdipoR₁/Gαi/AMPK/eNOS信号通路促进尿钠排泄。3、在SHR中,脂联素促尿钠排泄功能显著受损,其肾脏AdipoRs的磷酸化水平和GRK4的表达显著增高,提示脂联素在SHR中促利尿排钠功能受损主要与AdipoRs在肾脏组织被GRK4高度磷酸化修饰有关。4、GRK4 142V转基因可以明显增强小鼠肾脏AdipoRs磷酸化程度,损害脂联素促尿钠排泄功能,提示GRK4是负责肾脏AdipoRs磷酸化脱敏的关键激酶。5、AdipoR₁与D₁R协同促进尿钠排泄,其协同作用的缺失参与了原发性高血压的发生、发展。6、hD₅R^F173L转基因小鼠出现尿钠排泄受损、氧化应激升高、血压升高表型,主要与其D₅R发生高度磷酸化修饰,与Gαq、Gαs失偶联,进而激活PLC/PKC信号能力缺失,上调Trx1的作用受损,最终导致对钠泵的抑制作用缺失有关。