Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)作为一种重要的生物催化剂,具有选择性高、反应条件温和、高效等优点,可以催化各种有机酮/醛化合物的Baeyer-Villiger氧化反应,以及一些含硫、硒、硼等杂原子底物的非天然氧化反应。BVMO催化的选择性氧化反应已被广泛应用于各种手性化合物的合成中。近年来,利用生物信息学分析和基因挖掘技术,从众多微生物中找到了多种新型的BVMO;而利用蛋白质工程技术对已知的野生型BVMO进行改造,可以改善酶的立体、区域和化学选择性,扩大底物范围,提高酶的热稳定性和反应活性。随着国内外相关研究的进展,Baeyer-Villiger单加氧酶在有机合成中的应用将进一步得到拓宽。本论文通过对CHMO以及PAMO的蛋白质工程改造,以期提高其催化活性和选择性;并分别用这些突变株催化α-酮酯的还原反应以及硼有机化合物的氧化拆分反应,研究突变结构对2种非天然反应的催化活性和立体选择性的影响。具体研究内容和结果如下:首先,本论文根据CHMO催化Baeyer-Villiger氧化反应的机理,提出了利用CHMO催化循环中黄素的还原态将α-酮酯还原为α-羟基酯的假设,探讨了CHMO催化α-酮酯还原的多功能性反应。在选择苯甲酰甲酸乙酯作为模型底物底物并控制多个反应条件和多个对照实验的情况下,最终验证了CHMO的确具备相应的还原能力。进一步选择了CHMO活性中心附近的8个氨基酸残基进行定向进化,通过筛选后获得了具有优异活性和R构型立体选择性的突变株L143F,其ee值为98%,还获得了立体选择性反转的突变株F277L。继而利用CHMOL143F突变株考察了全细胞状态下,反应温度、诱导剂浓度、pH环境、沉淀菌株等条件对反应的影响。最后,设计了8种拓展底物研究了该还原反应的普适性和底物范围。其次,本论文研究了PAMO催化α-苯乙基频哪醇硼烷的非天然氧化拆分反应。但在全细胞环境中,野生型PAMO的立体选择性很差。定向进化研究发现,PAMO的活性位点Loop上67以及440-446位点与底物的特异性以及空间选择性有密切联系。我们选用野生型PAMO为模板,在上述6个位置进行定向进化,构建单突变文库。通过筛选,最终发现I67Q突变株可将产物立体选择性由野生型的25%(S)提高到72%(S),而S441E突变株实现了产物的优势构型由S逆转为及,产物的ee值为45%。考虑到硫醚类底物与模型底物的相似性,我们选择以突变株4M(167Q/P440F/A442N/L443I)为模板,将 67、440、442、443位点突变为不同大小以及不同酸碱性的氨基酸,进一步探索能实现更高尺构型立体选择性的突变株。最终发现构成4M的4种单突变的产物优势构型都是S构型,而4M突变的优势产物为及构型,进一步验证了杂原子氧化反应机理的相似性,但以4M为模板的其他突变并未获得高立体选择性的筛选结果。