施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是一株分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌,属于变形细菌Y亚族。在无氮源和微好氧的条件下,它能将空气中氮气固定为植物可以吸收利用的铵,是一种潜在的微生物肥料,具有重要的理论研究和实际应用价值。铵转运载体主要参与铵的运输和细胞内外铵的感应,具有维持生物体细胞内外氮素平衡的重要作用。固氮施氏假单胞菌A1501包含两个铵转运载体编码基因amtB1和amtB2,位于编码PII蛋白的glnK基因的下游,共同组成一个操纵单元。1.本文利用融合PCR的方法,在体外构建含氯霉素抗性盒的重组质粒,经过三亲结合的方法接合转移到野生型施氏假单胞菌A1501中,经同源重组双交换筛选到amtB1和amtB2的双缺失突变株,命名为ΔamtB,同时构建了其相应的回补株。2.在高铵和低铵的条件下,测定amtB1和amtB2的双缺失突变株ΔamtB的生长曲线,发现突变株相对于野生型生长情况下一致。在铵吸收测定实验中发现,突变株ΔamtB的铵吸收速率和野生型也基本一致。表明在正常情况下,细胞外的NH3分子可以通过自由扩散的方式进入细胞体内,维持细胞的正常生长。3.amtB1和amtB2基因缺失后,突变株的酶活有所下降,约为野生型的80%。在固氮条件下,用0.3mmM NH4+进行冲击,突变株ΔamtB的酶活基本不受影响,野生型和回补株的酶活都收到了抑制,持续大约3h后,酶活回复正常,表明了AmtB蛋白在铵冲击条件下参与了固氮酶活调节。4.用Real-time PCR分析固氮酶基因nifH和nifA在突变株和野生型中表达差异,实验结果表明在1mM NH4+铵冲击后,野生型的nifH和nifA的表达量分别下调了20倍和10倍,而突变株的nifH和nifA的表达量维持在80%和60%左右。5.在固氮条件下,突变株向培养基分泌少量的铵。然而将持续表达nifA的的质粒PVA3转入突变株和野生型中,突变株的酶活有所上升,泌铵量增加了一倍,而野生型的菌株没有检测到泌铵,表明AmtB在维持细胞内铵浓度方面起着重要的作用。6.将glnK基因克隆到表达载体pET28a中,并转入到BL21(DE3),用来表达带组氨酸标签的GlnK蛋白,纯化并制做了抗体,进一步用来研究AmtB与GlnK的相互作用,更好的诠释了AmtB的调节机制。7.建立了AmtB调节固氮酶活的机制。在固氮条件下,尿苷化的GlnK在细胞质中与NifL结合,释放了NifA蛋白的活性,从而激活了nif基因的转录活性。在铵冲击的条件下,即非固氮条件,GlnK蛋白脱尿苷化与AmtB1和AmtB2在膜上形成复合体,使其失去活性,阻止铵离子的进入,释放了NifL,使得NifL蛋白与NifA蛋白结合,阻止了NifA蛋白激活nif基因转录的活性,导致固氮酶活性的丧失；