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背景肝脏缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤是导致肝移植后并发症甚至移植失败的主要原因之一,而肝纤维化则会影响肝移植术后移植物长期存活,二者都与肝移植并发症关系密切,严重影响了手术的成功率和患者的预后,目前尚无有效的治疗手段。HBSP(Helix B surface peptide,B螺旋表面多肽)是来自EPO(Erythropoietin,促红细胞生成素)衍生的短肽,由11个氨基酸组成,其已经被证明具有强大的组织保护作用。本课题以HBSP作为干预手段,探讨了其在小鼠肝I/R损伤和肝纤维化疾病模型中的作用和相关机制。方法以下将分为两部分来阐述HBSP在小鼠部分肝缺血再灌注损伤和胆总管结扎诱导的肝纤维中作用的研究方法。本论文第一部分研究中我们探索了在小鼠肝I/R模型和氯化钴(Cobalt chloride,Co Cl2)诱导的细胞损伤模型中,HBSP调控肝细胞中的自噬及其机制。首先将C57BL/6J雄性小鼠随机分为6组:(1)假手术组,(2)I/R组,(3)I/R+HBSP组,(4)I/R+HBSP+3-MA(3-methyladenine,3-甲基腺嘌呤,自噬抑制剂)组,(5)I/R+HBSP+Rapamycin(雷帕霉素,m TOR抑制剂)组和(6)I/R+HBSP+3BDO(m TOR激动剂)组。其中(2)-(6)组行肝脏部分缺血/再灌注手术,(3)-(6)组行HBSP干预,(4)组使用3-MA抑制自噬水平,(5)组使用使Rapamycin抑制m TOR增强自噬的水平,(6)组使用使3BDO激活m TOR抑制自噬的水平。小鼠经肝部分缺血再灌注后取血清和肝脏分别用于检测ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天冬氨酸氨基转移酶)、LDH(乳酸脱氢酶)和H&E(Hematoxylin and eosin,苏木精&伊红)染色、TUNEL评价肝损伤程度,通过观察肝组织自噬小体和检测LC3Ⅱ(微管相关蛋白1轻链3α,Map1lc3),Beclin 1蛋白表达来判断自噬水平,通过检测p-m TOR,m TOR蛋白的表达水平,进一步研究HBSP调节自噬的机制。此外在体外我们以Co Cl2模拟缺氧环境来诱导肝细胞系AML12细胞缺氧损伤,设计(1)对照组,(2)Co Cl2组(Co Cl2诱导损伤的AML12细胞)和(3)Co Cl2+HBSP组(经HBSP处理后Co Cl2诱导损伤的AML12细胞),并通过流式检测细胞凋亡程度来评价HBSP对肝细胞损伤的保护作用和自噬双标腺病毒(Ad-m RFP-GFP-LC3)检测肝细胞中自噬体的功能状态来验证在肝细胞中HBSP对自噬的调节作用。在本论文的第二部分内容中我们探索了在胆总管结扎(Bile duct ligation,BDL)诱导的肝纤维化小鼠疾病模型中及巨噬细胞促进小鼠肝星状细胞(m HSCs)活化的细胞模型中,HBSP抑制巨噬细胞促纤维化效应的作用和机制。将C57BL/6J小鼠随机分为(1)假手术组,(2)BDL组(胆总管结扎组)和(3)BDL+HBSP组(HBSP干预组)。通过小鼠血清中ALT、AST和ALP(碱性磷酸酶)水平评估肝脏功能,然后通过Masson染色、天狼猩红染色(Sirius red)和α-SMA(α-smooth muscle actin,α-平滑肌肌动蛋白)、Collagen I(I型胶原蛋白)、FN1(Fibronectin1,纤连蛋白1)这些纤维化相关基因的表达变化来评估小鼠肝纤维化程度。此外我们通过检测肝组织中巨噬细胞标志分子F4/80蛋白的表达情况和Adgre1(F4/80)、Ly6c、IL-1β、TNF-α、TGF-β等分子的m RNA表达水平,以此探讨HBSP对肝脏巨噬细胞的影响。在体外,将实验分为(1)LPS(Lipopolysaccharides,脂多糖)组(LPS刺激的巨噬细胞),(2)LPS+HBSP组(经HBSP和LPS共同刺激的巨噬细胞),(3)LPS-R组(LPS组的培养上清处理的m HSCs),(4)LPS+HBSP-R组(LPS+HBSP组的培养上清处理的m HSCs),然后检测(1)、(2)组IL-1β、TNF-α、IL-6 m RNA表达水平和(3)、(4)组α-SMA、Collagen I、FN1的表达水平,验证HBSP是否对巨噬细胞功能有影响,并且进一步探讨其是否会通过巨噬细胞促进m HSCs的活化。另一方面为了研究HBSP是否直接对m HSCs活化有影响,用TGF-β分别刺激经HBSP干预和不经HBSP干预的m HSCs,同样检测了α-SMA、Collagen I、FN1基因的表达情况。结果第一部分研究结果发现,HBSP明显减轻肝脏I/R损伤,I/R+HBSP组中LC3Ⅱ/LC3I(LC3Ⅱ与LC3I的比值)和Beclin 1的表达以及自噬体的形成均高于I/R组,并且m TOR的磷酸化水平降低。我们还发现HBSP的保护作用一定程度上被3-MA所抑制,但却能够被自噬增强剂雷帕霉素进一步加强,而3BDO激活m TOR通路使得HBSP的肝脏保护作用明显下降。此外,体外的细胞实验结果也发现,HBSP促进自噬水平的升高,减轻了Co Cl2诱导的肝细胞损伤和凋亡。第二部分研究结果发现,在小鼠肝纤维化模型中,HBSP可以改善小鼠肝纤维化。经HBSP处理的小鼠肝脏α-SMA、Collagen I、FN1纤维化基因表达水平也下降。我们还发现BDL+HBSP组小鼠肝脏F4/80蛋白表达减少,IL-1β、TNF-α、TGF-β这些细胞因子表达下调,并且HBSP处理的巨噬细胞经LPS刺激后,其培养上清明显减少了m HSCs的活化,而HBSP直接作用于TGF-β刺激的m HSCs却并不能减少其活化。结论:首先我们证明了HBSP可能是通过抑制m TOR的磷酸化从而增强自噬来改善肝缺血再灌注损伤,另外我们发现HBSP除了可以改善肝I/R损伤以外,还可以减轻BDL诱导的小鼠肝纤维化,其可能是通过调控巨噬细胞,限制其相关细胞因子分泌从而减少m HSCs的活化来实现的。本研究探索了HBSP在肝脏缺血再灌注损伤和肝纤维化中的保护作用,为HBSP将来应用于临床治疗肝脏疾病提供了依据。