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染色体是生物遗传物质的载体。它的结构、形态、功能是细胞遗传学中的核心内容。染色体核型分析,是认识生物遗传、变异和进化的重要方法。现代科技的发展与完善,使分子生物学技术已经日益渗透到染色体研究中。荧光原位杂交技术(FISH)已成为连接细胞遗传学与分子遗传学的桥梁,使得我们可以在分子水平更加详细地研究染色体。
本研究在前人的基础上,一方面通过建立家蚕染色体核型模式以丰富家蚕细胞遗传学;另一方面利用FISH技术,对果蝇性别决定基因rbpl的同源体Bmrbpl在家蚕染色体进行了定位。现将研究结果总结如下:
1.家蚕染色体的核型模式调查了家蚕品种大造卵母细胞粗线期染色体,筛选了14个形态清晰、染色体数目完整的细胞。用Lucia染色体分析软件和ImageJ对其绝对长对和相对长对进行了测算。并用Lucia染色体分析软件软件对最好的一个细胞进行了自动核型排列。结果表明:不同细胞的染色体总长度差异较大,14个细胞染色体平均总长为360.015μm,最长为433.469μm,最短为273.183μm,两者相差160.286μm;其次,同一细胞内各染色体绝对长度也互不相同,最长染色体的长度与最短染色体的比值最大为2.984,平均为2.603,而且不同细胞相同序号染色体之间的长度差异也很大。如8号染色体最短的为11.088μm,最长的为18.345μm,相差达7.257μm。因此,绝对长度作为家蚕染色体核型分析的依据较小。但14个细胞相同序号染色体的相对长度比较接近,最高标准差为0.435,最低仅为0.136,相对绝对长度而言,差异更小。表明粗线期染色体的相对长度是一个比较稳定的数据,更加适合作为建立模式的参数。
另外,本研究还对粗线期染色粒进行了分析。每一条染色体都有其自身的粒数、面积大小、粒色浓淡、排列方式等特征可以互相区分开来。因此染色粒与染色体长度相结合,成为区分染色体的另外一个指标。通过对染色粒含量的计算,我们发现其在整个染色体群的各条染色体含量均较高。除了7条稍低(50﹪以下),50﹪以上的达到21条,占了整个群的75﹪,其中50-70﹪之间有13条,并出现有达到80﹪以上的染色体。证明了家蚕染色线的反复缠绕程度很高。通过对染色粒相对长度的统计,发现染色粒相对长度在1-3﹪之间的染色体比例最大,共25条,占到89.3﹪;3﹪以上的只有3条,仅占10.7﹪。和染色粒含量相比,其相对长度差异更小,比如相对长度的最大差值为2.768﹪,而染色粒含量的最大差值却可达到55.356﹪。
最后,综合以上的四种参数,建立了一个家蚕减数分裂染色体的核型模式图,初步反映每条染色体各自的特征。
用Lucia染色体分析软件和ImageJ软件来测量家蚕粗线期染色体相对长度和绝对长度与传统的细铜丝测量相比,减少了步骤,降低了主观误差,尤其是对染色体进行核型排列时,不需要手工的剪贴,大大提高了准确性和工作效率。
2.Bmrbpl的FISH研究以DIG标记Bmrbpl作为探针,对家蚕不同时期染色体细胞进行原位杂交,染色体用PI复染。结果发现:在雄蚕、雌蚕的有丝分裂间期和中期染色体都有两个黄色杂交信号存在;并在雄蚕、雌蚕减数分裂间期、粗线期和中期Ⅰ也都发现有单一的杂交信号,初步证实了该基因在基因组中是一个单拷贝的基因。但是相对于哺乳动物而言,信号检出率偏低。其中,间期杂交率最高(平均为36.35﹪);粗线期次之,为16.5﹪;中期最低有丝分裂中期为9﹪,减数分裂中期Ⅰ为8.2﹪。并对14个有杂交信号、分散良好的粗线期染色体进行核型分析。发现该信号位于相对长度为4.386﹪的染色体上,该染色体是染色体核型模式图中的第5号染色体。同时我们还对位于第5号染色体的信号位置利用ImageJ进行了测算,结果表明该位点在该条染色体上的相对位置为38.806±1.080﹪(信号位点与近端长度;该染色体长度)。中期Ⅰ上的杂交信号位置很难确定,因为染色体浓缩成颗粒状,差异甚微。