研究目的:2型糖尿病(T2DM)在世界范围内广泛流行。在我国,T2DM的发病率高达11.1%。大量流行病学调查表明糖尿病患者的骨折风险明显高于普通人群。且常在相对正常甚至较高的骨密度(BMD)水平下发生骨折,这一现象与原发骨松的低BMD不同。因此,T2DM对骨质结构的影响成为近年的研究热点。骨质结构分为松质骨与皮质骨两方面。皮质骨是骨组织中主要的承重部分,其细微结构的改变较之松质骨更易引起骨强度的改变。T2DM患者的骨折常发生于四肢皮质骨区域,而使用高分辨率外周定量计算机断层扫描(HR-pQCT)以及Micro-CT三维成像技术发现T2DM患者以及T2DM大鼠模型的皮质骨结构损害,孔隙率增高,微裂隙增多,骨强度下降。可见,研究T2DM患者的皮质骨结构改变的机制,对于发掘T2DM患者骨折风险升高的原因具有重要的意义。骨细胞占皮质骨细胞总数的90%以上,在骨形成与骨重塑过程中都起到关键的调节沟通作用。骨细胞可以通过树状突起形成庞大复杂的细胞间网络,并联系细胞表面的成骨细胞,破骨细胞,骨髓中的间充质干细胞,通过分泌骨硬化蛋白(sclerosis),以及RANKL等多种活性分子,调控平衡各类骨组织中细胞的活性与功能,从而维持骨质的稳态。骨细胞还是骨骼对应力的主要感受器。在骨细胞周围的微环境以及骨细胞内,机械应力信号能够逐步转换为化学信号,并通过骨细胞网状结构逐步扩散,进而调节成骨与破骨平衡。在对T2DM患者及T2DM大鼠模型的观察研究中发现,皮质骨中骨细胞体积增大,数目减少。计算机拓补数学模型分析结果表明,T2DM大鼠模型中骨细胞网状结构连接紊乱,单一节点连接细胞数目差异较非T2DM组增大。但引起骨细胞的上述形态结构改变的原因尚不清楚。缝隙连接(Gap junction,GJ),是位于细胞膜上的,控制细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间信号通讯与物质传输的一种重要膜通道结构,在骨细胞网状结构的形成与物质运输中皆起到重要作用。Connexin43(Cx43)是骨细胞中表达最多的缝隙连接蛋白。Cx43基因缺陷会导致全身骨骼功能异常,骨骼矿化延迟以及颅骨畸形。骨细胞特异性缺乏Cx43的小鼠骨骼对机械卸载的反应迟钝,逆向证明Cx43是骨细胞感受机械应力的必要条件。缺乏Cx43蛋白的小鼠皮质骨呈现出衰老相关表型,而过表达骨细胞中的Cx43则可以减轻骨组织的衰老状态。此外,Cx43在骨细胞抗氧化应激方面也起到重要作用。Cx43敲除的骨细胞对氧化应激诱导的细胞死亡的敏感性增加。而氧化应激也是T2DM重要的致病机制之一。鉴于Cx43及其构成的全通道与半桶道在骨细胞存活、抗氧化应激、机械应力感受等的各方面的重要作用,我们猜测骨细胞中的Cx43及其构成的全通道与半通道可能参与T2DM骨细胞形态、网状结构改变的病理过程。本研究的目的:通过观察高糖作用下骨细胞内Cx43的表达及其缝隙连接通道功能的变化,进一步深入探究其可能机制,为T2DM所致的皮质骨结构损害提出新的可能致病机制及治疗方向。研究方法:采用小鼠骨细胞系MLO-Y4细胞。不同浓度的高糖作用后,使用Western blot以及免疫荧光检测MLO-Y4细胞内Cx43的变化趋势。使用染料划痕失踪实验与染料摄取实验,分别检测高糖作用后MLO-Y4细胞内Cx43全通道与半通道功能的变化情况。根据制定的入选排除标准,收集临床上T2DM及非T2DM患者因骨质疏松性股骨颈骨折行髋关节置换手术时的股骨颈处皮质骨标本,经HE染色及免疫组化分析观察T2DM患者皮质骨内骨陷窝情况及骨细胞内Cx43的表达情况。在此基础上,进一步检测与Cx43细胞内化降解相关的P38MAPK/ERK信号通路在高糖作用下的活化情况,探究高糖导致Cx43表达降低及其通道功能降低的可能机制。研究结果:1、通过CCK8细胞活力检测,发现高糖作用下MLO-Y4细胞活力缓慢降低,并具有剂量依赖性。2、通过Western-blot以及免疫荧光检测得出,高糖作用下,MLO-Y4细胞中Cx43蛋白表达降低。3、分别采用划痕染料示踪实验与染料摄取实验,结果显示高糖作用下,MLO-Y4细胞中Cx43通道与半通道的功能降低。4、收集到的T2DM患者及同年龄段非T2DM患者股骨颈骨折处皮质骨标本。经固定,脱钙。组织切片后经HE染色观察显示:与非T2DM患者相比,T2DM患者皮质骨中空的骨陷窝比率增加。5、免疫组化分析结果得出:T2DM患者皮质骨骨细胞中,Cx43表达较非T2DM患者降低。6、通过提取高糖处理后的MLO-Y4细胞膜蛋白,经由Western-blot检测得出高糖作用下MLO-Y4细胞膜蛋白中Cx43表达亦减少。7、Western blot检测高糖作用下的MLO-Y4细胞中p38MAPK/ERK1/2信号通路关键蛋白表达增加,证明该通路被活化。该信号通路与细胞膜内Cx43蛋白的内化相关。8、p38MAPK的抑制剂PD98059以及ERK抑制剂U0126可以部分恢复由于高糖而表达降低的Cx43蛋白水平,还可以部分逆转高糖作用下Cx43通道与半通道的功能降低。9、高糖作用下,MLO-Y4细胞内自噬标志蛋白LC3I/II表达增高。结论:高糖能够降低骨细胞系MLO-Y4的细胞活力,降低MLO-Y4细胞内Cx43蛋白的表达以及其构成的全通道与半桶道的功能。高糖的这一作用是通过活化Cx43蛋白内化通路p38MAPK/ERK1/2实现的。内化后的Cx43蛋白则通过活化的自噬途径而迅速降解。抑制该通路可以部分逆转由于高糖作用而降低的Cx43通道与半桶道的功能。