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新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒,可导致石斑鱼死亡率达90%以上,给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。形态、结构、生理生化及全基因组序列分析揭示SGIV为虹彩病毒科蛙病毒属的一个新种。SGIV是具有囊膜的大分子DNA病毒,囊膜在病毒感染、复制及致病过程中起重要作用。研究囊膜蛋白对于阐明病毒感染和致病的分子机理具有重要的科学意义,也可为有针对性地研究和开发病毒防控技术提供理论依据。
本研究通过纯化病毒SGIV,用Triton X-100处理纯病毒成功分离囊膜后,采用两种方法对SGIV囊膜蛋白组进行系统研究。通过1-DE-MALDI workflow鉴定分离的囊膜蛋白,初步发现9个病毒编码的蛋白。通过LC-MALDI workflow鉴定发现19个囊膜蛋白,其中4个蛋白是经两种方法均得到验证的。发现的24个囊膜蛋白中,12个蛋白是首次被鉴定发现。进一步分析鉴定的囊膜蛋白中15个蛋白(62.5%)含有跨膜区,4个蛋白白虹彩病毒科核心基因编码。
我们进一步对质谱初步鉴定的囊膜蛋白 SGIV VP90进行了深入研究。从SGIV基因组中克隆了ORF090L全长基因,并进行了原核表达,重组蛋白纯化和免疫小鼠制备抗体。通过RT-PCR、Western-blot分析,结合药物抑制实验,揭示ORF090是一个晚期基因。免疫荧光显微镜观察,结果显示该基因表达在GP细胞的细胞质中。免疫电镜结果进一步表明VP90定位于病毒囊膜。体外抗体中和实验揭示VP90在病毒感染过程中可能起重要作用。
为了弄清病毒结构蛋白在病毒感染中的作用,结合生物信息学分析,我们选取ORF038L作为候选基因进行研究,SGIV ORF038L编码170个氨基酸,含有一个保守的RGD结构域。从SGIV全基因组中克隆了ORF038全长基因,进行了原核表达,并免疫小鼠制备出抗体。转录表达时序分析表明,SGIV ORF038L在感染细胞后8h开始转录,24h开始表达。结合药物抑制实验,揭示ORF038是一个晚期基因。免疫荧光显微镜观察,结果显示VP38在感染细胞中主要聚集在病毒加工厂周围。Western blot和免疫电镜结果表明VP38定位于病毒衣壳,是一种病毒衣壳蛋白。抗体中和试验和Pull-down实验结果表明SGIV VP38在病毒感染过程中可能起重要作用。