研究背景:近年来,随着肿瘤的发生率和致死率的不断提高,肿瘤已经成为全球性的公共健康问题而备受关注,肿瘤已经成为我国乃至全球性的公共健康问题,其中,乳腺癌在女性中的发生率始终居于高位,严重威胁着女性群体的健康。乳腺癌根据分子表达分为不同亚型,其中超过70%为雌激素受体(ER)阳性乳腺癌。在过去数十年来,他莫昔芬(Tamoxifen)一直是ER阳性乳腺癌最重要的内分泌辅助治疗药物,然而不幸的是,许多患者,包括用药初始阶段对药物有反应的ER阳性乳腺癌患者,在治疗中都出现了Tamoxifen耐药的情况。关于其耐药的可能机制,众说纷纭,而细胞的代谢重编程可能是药物耐受的重要原因之一。细胞的能量代谢影响着细胞的生存发展,肿瘤细胞的异常代谢引起了人们的极大关注。线粒体是能量代谢的重要场所。肿瘤细胞的线粒体往往存在功能异常。近年来的研究证实,线粒体融合/分裂在肿瘤的发生发展中可能扮演着重要角色。动态线粒体网络的维持对信号转导,ATP产生具有重要影响。线粒体形态上的转换也涉及细胞的存活,凋亡及其代谢稳态。然而,线粒体融合/分裂是否参与肿瘤细胞Tamoxifen耐药目前尚不明确。目的:探索Tamoxifen耐药细胞的代谢模式及线粒体形态功能的差异,并明确耐药细胞线粒体形态和代谢重编程的调控机制,为有效监测和逆转Tamoxifen耐药提供重要的新思路、新靶点。方法:1.建立ER阳性乳腺癌细胞MCF7、T47D的Tamoxifen耐药细胞株。通过STR测序分析鉴定细胞,细胞计数器分析细胞形态,运用MTT、细胞平板克隆形成实验检测耐药细胞株的生物学功能差异。2.检测亲本和耐药细胞株的糖代谢情况。通过qPCR和Western Blot实验筛选可能参与耐药细胞代谢重编程的重要分子,用2-NBDG摄取实验检测亲本和耐药细胞的糖摄取情况,利用葡萄糖检测试剂盒检测细胞的糖利用,使用Seahorse能量代谢检测仪分析亲本和耐药细胞的糖酵解及氧化磷酸化的差异。3.观察线粒体形态与功能。通过JC-1染色检测细胞的膜电位,利用Mito-Tracker染色与透射电镜(TEM)观察亲本和耐药细胞线粒体形态,检测细胞ATP合成、活性氧(ROS)生成分析线粒体生物学功能。4.分析线粒体融合/分裂参与细胞耐药代谢重编程的分子机制。利用qPCR和Western Blot实验筛选线粒体融合/分裂相关分子中,参与细胞耐药的关键分子及其上游相关分子的表达。对关键分子进行过表达和干涉实验,检测关键分子发挥的生物学功能。利用荧光报告基因,Chip等实验分析调控机制。结果:1.亲本和耐药细胞的大小并没有显著差异。耐药细胞株对Tamoxifen的耐受性显著增强。2.MCF7和T47D耐药株均呈现出糖摄取和糖利用增强,对糖酵解通路的相关重要酶分子检测,MCF7耐药株(MCF7/TR)和T47D耐药株(T47D/TR)相对于各自亲本细胞的表达趋势略有差异,ECAR结果MCF7/TR细胞展现出糖酵解能力高于亲本细胞(MCF7/P),而T47D/TR与其亲本T47D/P的糖酵解没有显著差异,但是氧化磷酸化OCR检测,两种耐药细胞株OCR均显著高于各自亲本细胞。3.MCF7/TR和T47D/TR的膜电位势能高于各自亲本细胞,TEM以及Mito-Tracker染色观察发现MCF7/TR细胞线粒体狭长,嵴结构更为紧密。MCF7/TR和T47D/TR的ATP含量高于亲本,而ROS含量显著低于亲本细胞。4.线粒体内膜融合相关蛋白视神经萎缩蛋白1(OPA1)在两种耐药株中高表达与细胞耐药和耐药细胞代谢关系密切。耐药株中干涉OPA1表达,增强耐药细胞对tamoxifen敏感性,提高细胞ROS水平,OCR指标下降,线粒体脊结构松散。在亲本细胞中过表达OPA1,提高细胞对tamoxifen的耐受,降低细胞ROS,OCR指标提高,线粒体脊结构更为紧密。AKT-mTOR-P65信号轴参与调控OPA1的表达。结论:AKT-mTOR-P65信号通路活化促进了OPA1表达,从而改变了耐药细胞的代谢模式,促进细胞对tamoxifen耐受。