【背景】阿尔茨海默病(AD)是以记忆缺陷和认知衰退为特征的进行性神经退行性疾病。该疾病的主要两大特征是细胞内tau过度磷酸化形成的神经纤维缠结和细胞外Aβ短肽形成的老年斑。然而,Aβ斑块和神经纤维缠结不足以解释AD的所有特征,并且皮质斑块的水平和与AD相关的认知障碍之间没有真正的相关性,临床用免疫治疗方法降低大脑Aβ水平的试验并没有改善AD患者的认知功能虽然有证据显示Aβ斑块的清除。在AD早期,基底前脑胆碱能神经元发生性变,最终导致它投射到的靶向核团如海马、新皮层、杏仁核等区域胆碱能递质缺失,随着这些投射的丢失,认知功能逐渐下降。如果在AD的早期能找到胆碱能神经元丢失的分子机制,那么对于AD患者的治疗将提供新的治疗思路和措施。在我们早期的研究中发现DAPK1(死亡相关蛋白激酶1)通过与不同底物(如:tau、NR2B、p53)结合,介导了脑缺血时的神经元的突触损伤以及激活多条细胞死亡通路,最终导致神经元凋亡或坏死,DAPK1与底物结合的重要区域主要是激酶域、死亡域、钙调蛋白结合结构域,而DAPK1通过激酶域与tau结合介导缺血性损伤的作用已被证实,本研究将在前期工作的基础上,利用转基因的手段来干扰胆碱能神经元中DAPK1的活性,结合行为学,分子生物学以及电生理的方法,发现,在AD发生的早期抑制DAPK1能够有效地治疗老年痴呆早期神经退变和记忆丢失。提示DAPK1在老年痴呆治疗中的重要作用。【目的】(1)明确老年痴呆早期DAPK1介导胆碱能神经元的退变;(2)确定老年痴呆早期DAPK1介导胆碱能神经元死亡的分子机制;(3)探讨以DAPK1为靶标治疗老年痴呆的新策略。【方法】首先我们通过向小鼠双侧侧脑室注射合成的人源性Aβ1-42来构建老年痴呆小鼠模型,然后通过免疫印迹(Western Blotting)的方法来检测tau磷酸化的水平、ChAT的含量,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法来检测小鼠海马组织中Aβ的含量,通过水迷宫(Water Morris)来检测小鼠的空间学习记忆,通过条件恐惧实验(Fear Conditioning)来检测小鼠的恐惧记忆,通过旷场(Open Field)和十字高架(Elevated Plus Maze)来检测小鼠的自发活动和焦虑样情绪,通过电生理膜片钳(Patch Clamp)的方法来检测长时程增强(LTP)、自发兴奋性突触后电流(s EPSC)、自发抑制性突触后电流(s IPSC),通过苏木素染色(Hematoxylin Staining)来检测小鼠脑部结构,通过PCR技术来鉴定小鼠基因表型,通过荧光定量PCR技术来检测DAPK1 m RNA的含量,为了获得胆碱能神经元特异敲除死亡相关蛋白激酶激酶域的小鼠,我们将条件性诱导敲除的DAPK1-KD小鼠与胆碱能神经元中表达Cre重组酶的ChAT-IRES-Cre ER转基因小鼠杂交,双转后代在他莫昔芬(Tamoxifen)的诱导下即可。【结果】1.构建老年痴呆小鼠模型Aβ1-42注射到侧脑室后7d、14d、28d进行相关检测,发现海马依赖的场景记忆的损伤发生在Aβ1-42注射后7d,而内源性Aβ40、Aβ42的含量以及tau蛋白磷酸化水平的升高发生在注射后第14d。2.突触功能的损伤发生在Aβ1-42注射后7d通过电生理的方法证实在Aβ1-42注射后7d即发生突触功能的损伤,主要表现在自发兴奋性突触后电流频率增加,幅度不变,抑制性自发突触后电流频率不变,但是幅度降低;通过记录CA1锥体神经元场电位,发现LTP难以诱发以及维持。3.Aβ1-42注射到侧脑室导致胆碱能系统损伤Aβ1-42注射到侧脑室后7d,MS/VDB区域胆碱能神经元数量与对照组相比无显著变化,但海马区乙酰胆碱酯酶活性升高,胆碱能神经元标记物ChAT含量较对照组显著降低。4.成功构建胆碱能神经元特异性敲除死亡相关蛋白激酶激酶域转基因小鼠将条件性诱导敲除的DAPK1-KD小鼠与胆碱能神经元中表达Cre重组酶的ChAT-IRES-Cre ER转基因小鼠杂交,双转后代在他莫昔芬(tamoxifen)的诱导下获得特异性在胆碱能神经元中敲除DAPK1激酶域的转基因小鼠。q PCR的结果显示纹状体以及基底前脑区域双转小鼠DAPK1m RNA含量相较于对照组显著下降,并且敲除DAPK1中的激酶域不影响小鼠的生长、不影响小鼠大脑的结构、不影响小鼠的自发活动以及情绪。5.敲除DAPK1的激酶域保护胆碱能系统损伤在DAPK1-KD转基因小鼠侧脑室注射Aβ1-42后7d,对小鼠海马组织中乙酰胆碱酯酶的活性以及ChAT蛋白的表达进行检测,结果显示,敲除DAPK1中的激酶域能保护胆碱能系统损伤。6.敲除DAPK1的激酶域保护突触功能损伤在Aβ1-42侧脑室注射7d后,对各组小鼠进行电生理检测,结果显示,海马CA1区s EPSC、s IPSC的损伤均恢复到正常水平;CA3-CA1的长时程增强损伤也得到改善;7.敲除DAPK1的激酶域改善小鼠学习记忆行为表型Aβ1-42注射7d后,水迷宫结果显示DAPK1激酶域敲除的小鼠空间学习能力显著提高,并且恢复到与对照组相似的水平;情景恐惧实验结果表明敲除DAPK1激酶域改善情绪记忆障碍。【结论】在Aβ1-42模拟的老年痴呆模型中,胆碱能系统的损伤和突触丢失发生在早期,特异性敲除胆碱能神经元DAPK1中的激酶域保护突触功能的损伤以及学习记忆行为表型。