南海是位于中国南部的陆缘海,西太平洋的一部分,属于印度—西太平洋海洋生物地理区系,是世界上海洋生物种质资源最为丰富的区域之一。南海蕴藏着丰富的鱼类资源,是生产供应优质动物蛋白,建设蓝色粮仓的重要区域。已有的研究调查统计显示南海鱼类有3000多种,其隶属于3个纲、35个目、236个科和822属[1-3]。鱼类的种类鉴别需要丰富的专业知识和经验,特别是形态相似的近缘种,更是从形态上难以区分。近年来发展起来的DNA条形码技术为鱼类物种鉴别提供了一种快速有效的方法,而建立完善的DNA条形码数据库是利用DNA条形码技术进行鱼类、鱼卵和仔稚鱼鉴定的基础。因此,在国家基础性工作专项的支持下,本研究开展了南海鱼类凭证标本的收集保存和DNA条形码数据库构建工作,并利用建立的DNA条形码技术开展了鱼卵种类鉴别研究,取得的主要结果如下:1.南海鱼类凭证标本收集保存和DNA条形码数据库构建。采集和保存了 518个样品,通过形态鉴定隶属于26目,91科,152属,219种。将518个样品分别提取基因组DNA,利用鱼类线粒体COI基因通用引物,扩增样品的线粒体COI基因,并进行测序分析,其中419个样品获得了有效的COI序列信息,经与BOLD数据库比对分析,其中407个样品COI条形码信息在在BOLD数据库中有相应条形码序列,分别属于19目,73科,123属,164种,每个鱼类物种包含1～8个个体数,平均每个物种有2.48个个体,包含2个及2个以上个体的有93种;其余12个样品隶属于5个种,在BOLD数据库中没有相应的条形码序列。利用419个样品COI序列进行聚类分析,结果表明未出现碱基的插入和缺失,419条序列的平均碱基组成分别为T:29.7%,C:28.3%,A:23.3%和G:18.3%,其中A+T平均含量(53.0%)明显高于G+C平均含量(46.6%),表现出AT碱基偏倚性。密码子第三位点GC含量最高(48.5%),第一位点次之(46.5%),第二位点最低(43.8%)。三个密码子A+T含量的差异不大,第一密码子位点的A+T平均含量最大为53.4%。利用MEGA5.0软件的K2P模型计算遗传距离,种内遗传距离与种间遗传距离的变化范围分别为0.0000-0.0208 (平均值 0.0027)和 0.0012-0.4812 (平均值 0.2298),种间遗传距离为种内距离的85倍,土佐湾楔花鮨鰧(Sphenanthias tosaensis)种内个体间遗传距离最大为0.0208;掘氏棘金眼鯛(Centroberyx druzhinini)与红尾棘金眼鲷(Centroberyx rubricaudus)之间的种间遗传距离最小为0.0012。159个物种(94.1 % )可以聚为独立分支,并有非常高的置信度。黑缘尾九棘鲈(Cephalopholis spiloparaea)和索氏九棘鲈(C.sonnerati),截尾鸚嘴鱼(Scarus rivulatus)和瓜氏鹦哥鱼(S.quoyi),头绒毛鲨(Cephaloscyllium isabellum)和阴影绒毛鲨(C. umbratile),掘氏拟棘鯛(Centroberyx druzhinini)与金眼拟棘鯛(C.rubricaudus),康德锯鳞鱼(Myripristis kuntee)与白边锯鳞鱼(Mmurdjan),这些同属的鱼类种内的个体间不能聚为单系支,线粒体COI基因作为条形码时,这些种间缺乏遗传距离间隔,因此不能有效区分这些种类,应开发其他适宜的DNA条形码序列来鉴别这些种类。2.永暑礁泻湖鱼卵鉴定分析。采集到的71个鱼卵样品通过PCR扩增测序获得了 30个COI碱基序列,测序成功率为42.3%。采集的71个鱼卵样品根据外部形态特征初步划分为圆形和椭圆形2种类型,圆形鱼卵44个,椭圆形鱼卵27个。44个圆形鱼卵中有27个测序成功,测序成功率达61.4%; 27个椭圆形鱼卵中有3个测序成果,测序成功率仅为11.1%。30个鱼卵线粒体COI序列分别于BOLD数据库比对分析,结果显示与BOLD数据库中参考序列相似性在99.6～100%之间,30个鱼卵均能鉴定到种的水平,分属于1个目,7个科,13个种。刺尾鱼科(Acanthuridae)有5个种,共有19个鱼卵,占鉴定鱼卵总数的63.3%;鹦哥鱼科(Scaridae)有2个种;隆头鱼科(Labridae)有2个种,分;鲹科(Carangidae)有1个种;篮子鱼科(Siganidae)有1个种;笛鲷科(Lutjanidae)有1个种;鲽鱼科(Zanclidae)有1种。双斑栉齿刺尾鱼有10个鱼卵,白尾栉齿刺尾鱼有4个鱼卵,这两个种为该海域的优势种类,其余各种类均为1～2个鱼卵。在K2P双参数替代模型(Kimura 2-parameter,K2P)的统计下,结果显示,种内的K2P遗传距离为0～0.002,同一个属种间的遗传距离为0.4～0.132,而同一个科不同属间的遗传距离为0.117～0.185。根据K2P模型利用遗传距离构建的邻接系统进化树显示,相同的种类聚为一个分支;刺尾鱼科中的刺尾鱼属和栉齿刺尾鱼属聚为一支,而与同一科的鼻鱼属未形成单系支。3.广东省江门广海湾和川岛群岛附近海域鱼卵鉴定分析。以江门海域采集到的鱼卵研究对象,利用DNA条形码技术分析鉴定鱼卵种类。共获得鱼卵317个个体,有效线粒体COI序列信息217个,测序成功率为68.5%。经BOLD数据库比对分析,成功鉴定鱼卵14科19属20种;种内遗传距离为0～0.006,平均遗传距离为0.002,种间遗传距离为0.149～0.325,平均遗传距离为0.255,种间遗传距离为种内遗传的128倍;基于鱼卵的COI序列构建的系统进化树显示,所有种类能聚为独立分支,且具有较高支持度。该研究结果表明DNA条形码技术可作为鉴定鱼卵的有效的方法,可广泛应用于沿海海域鱼卵鉴定工作。