目的:小RNA-140（microRNA-140,miR-140）在软骨细胞的分化、代谢等过程中发挥重要作用,而miR-140在软骨损伤修复过程中的作用及其机制尚有待深入研究。本课题探讨核定位信号肽偶联核激酶底物短肽修饰的壳聚糖(Nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide-conjugated chitosan,^NNSCS)介导miR-140基因对兔关节软骨损伤修复的作用及其机制。方法:以人全血标本基因组为模板,PCR扩增pri-miR-140基因序列,并将该序列定向克隆入GV268真核表达载体,构建重组质粒GV268-miR-140。使用核定位信号肽偶联核激酶底物短肽（Nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide,NNS）修饰壳聚糖（chitosan,CS）(^NNSCS),并与含有增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因的质粒pEGFP-C1复合形成^NNSCS/pEGFP复合物。体外分离培养乳兔关节软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定。将^NNSCS/pEGFP复合物瞬时转染第2代关节软骨细胞,观察GFP阳性细胞测定^NNSCS的转染效率。体外实验:将^NNSCS分别与GV268-miR-140重组质粒及GV268阴性对照质粒复合形成^NNSCS/GV268-miR-140和^NNSCS/GV268复合物。取第2代关节软骨细胞接种细胞培养板,实验分三组:A组转基因组,B组阴性对照组,C组正常细胞对照组。A组给予^NNSCS/GV268-miR-140复合物,B组给予^NNSCS/GV268复合物,C组给予同质量体积的^NNSCS。瞬时转染后,实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR）检测miR-140的表达;MTT法及Annexin V-FITC/PI双标记法分别检测miR-140对软骨细胞增殖活力及凋亡的影响;RT-qPCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测软骨细胞内成软骨相关基因Sox9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）和组蛋白去乙酰化酶4（Histone deacetylase 4,Hdac4）的表达。体内实验:健康雄性新西兰大耳白兔18只,单侧右后肢随机分成3组:A组转基因组,B组阴性对照组,C组假手术组,n=6。A组与B组均制备股骨滑车全层软骨损伤模型;C组仅暴露股骨滑车关节面。手术1周后,进行关节腔内注射,A组给予^NNSCS/GV268-miR-140复合物,B组给予^NNSCS/GV268复合物,C组给予等量等渗盐水,每周2次,持续7周。术后8周末处死实验动物并取材。RT-qPCR检测缺损区周围软骨组织内miR-140、Sox9、Aggrecan和Hdac4基因表达;HE染色、番红O-固绿染色及Aggrecan免疫组织化学染色评估缺损区软骨修复情况。结果:成功构建GV268-miR-140真核表达质粒,并与^NNSCS复合形成^NNSCS/GV268-miR-140复合物。^NNSCS将pEGFP-C1成功转入经甲苯胺蓝染色鉴定后的软骨细胞内,转染效率接近40%。体外实验:MTT检测显示,A组软骨细胞增殖活力（150.3±10.3%）较B组（107.3±5.3%）和C组（100.0±5.6%）明显提高（P<0.05）。流式细胞仪检测显示,A组软骨细胞凋亡率（7.05±0.263%）较B组（10.37±0.163%）和C组（9.87±0.093%）明显降低（P<0.05）。RT-qPCR检测显示,A组miR-140基因表达水平（5.87±0.543）较B组（1.27±0.143）和C组（1.00±0.110）明显升高（P<0.05）;A组miR-140过表达明显上调Sox9、Aggrecan基因mRNA表达（Sox9:4.97±0.558,Aggrecan:3.00±0.140）及下调Hdac4基因mRNA表达（0.63±0.060）,较B组（Sox9:1.30±0.340,Aggrecan:1.23±0.080,Hdac4:1.08±0.063）和C组（Sox9:1.00±0.130,Aggrecan:1.00±0.070,Hdac4:1.00±0.030）（P<0.05）。Western blot检测结果与RT-qPCR检测结果一致,A组miR-140过表达明显上调Sox9、Aggrecan蛋白表达（Sox9:0.592±0.010,Aggrecan:2.287±0.117）及下调Hdac4蛋白表达（0.451±0.008）,较B组（Sox9:0.460±0.012,Aggrecan:1.593±0.009,Hdac4:0.752±0.025）和C组（Sox9:0.464±0.008,Aggrecan:1.507±0.057,Hdac4:0.754±0.007）（P<0.05）。体内实验:RT-qPCR检测结果显示,A组miR-140基因表达水平（2.603±0.334）较B组（0.882±0.105）和C组（1.022±0.225）明显升高（P<0.05）;A组miR-140过表达明显上调Sox9、Aggrecan基因mRNA表达（Sox9:3.697±1.042,Aggrecan:2.726±0.430）,较B组（Sox9:0.919±0.078,Aggrecan:0.880±0.104）和C组（Sox9:1.008±0.143,Aggrecan:1.008±0.132）（P<0.05）。B组Hdac4基因mRNA水平（4.434±1.187）最高,其余依次是A组（2.552±0.182）和C组（1.055±0.362）;A组miR-140过表达明显下调Hdac4基因mRNA表达较B组（P<0.05）。HE染色、番红O-固绿染色及Aggrecan免疫组织化学染色显示,A组缺损处呈现明显的软骨性修复,B组缺损处出现大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,未见软骨性修复。结论:（1）^NNSCS可携带外源基因进入软骨细胞并有效释放。（2）MiR-140可提高体外培养软骨细胞的生物活性。（3）关节腔内注射^NNSCS/GV268-miR-140复合物可促进损伤软骨的修复,此作用的发挥可能与上调Sox9、Aggrecan基因及下调Hdac4基因表达有关。