目的设计针对H5N 1高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)聚合酶蛋白PA (polymerase acidic, PA)基因和核蛋白(nucleo-protein, NP)基因序列特异性的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyrib-onucleotides, AS ODNs),研究其在细胞水平和小鼠体内抑制流感病毒复制的能力。方法根据AS ODNs药物设计原则,设计并合成3条针对HPAIV PA基因保守区位点的AS ODNs (PA4、PA492和PA1203)和3条针对NP基因保守区位点的AS ODNs (NP267、NP628和NP749),序列比对分析显示PA492和2009甲型H1N1流感病毒PA基因也完全匹配。在MDCK细胞水平上通过血凝试验(hemagglutinin assay, HA)、TCID50病毒滴度(50% tissue culture infective dose, TCID50)检测、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)和荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT PCR)试验检测AS ODNs抑制流感病毒复制的能力。进一步使用致死剂量的H5N1禽流感病毒或H1N1甲型流感病毒(针对PA492)感染小鼠,通过对小鼠存活率和体重变化的观察检测反义核酸PA492和NP628对小鼠的保护,同时在感染后的不同时间(感染后2天、4天和6天)通过检测小鼠体内肺病毒滴度(viral titer)和肺感染指数(lung index)验证AS ODNs在小鼠体内抑制流感病毒复制的能力。结果设计的6条AS ODNs在MDCK细胞上均能不同程度的抑制H5N1禽流感病毒的复制,浓度为4gM的AS ODNs转染后6h能够达到94.4%的转染效率针对禽流感病毒PA基因设计的AS ODNs中,PA492在MDCK细胞上显示最佳的抗病毒活性,病毒滴度和对照组相比降低了29倍；针对禽流感病毒NP基因设计的3条AS ODNs中,NP628在MDCK细胞上显示最佳的抗病毒活性,病毒滴度和病毒对照相比降低了17倍；小鼠体内的攻毒保护试验显示PA492和NP628均能保护部分小鼠免受致死剂量H5N1禽流感病毒的攻击,保护率分别为50%和37.5%；同时PA492也能有效地保护小鼠免受致死剂量甲型H1N1流感病毒的攻击,保护率达80%：进一步不同时间感染小鼠的体内肺病毒滴度和肺感染指数试验结果也显示PA492和NP628能抑制H5N1或H1N1流感病毒在小鼠体内的复制。结论本研究针对H5N1禽流感病毒的PA基因和NP基因保守区位点设计的ASODNs能在MDCK细胞水平和小鼠体内有效地抑制流感病毒复制和增殖,提高小鼠的存活率,为AS ODNs药物对高致病性禽流感的治疗提供了合理的技术支持和药物储备。背景近年来H5N 1亚型高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)在中国的频繁暴发给人们的生命健康带来了严重威胁,造成了巨大的经济损失。禽流感病毒表面有三个跨膜蛋白：血凝素(hemagglutinin antigen, HA)、神经氨酸酶(neuraminidase, NA)和基质蛋白2(matrix protein 2, M2)。血凝素是禽流感病毒表面主要的免疫原,在流感病毒感染过程中具有关键的作用,在病毒感染细胞表面大量存在,是当前特异性抗体的主要靶标,也能作为流感病毒靶向治疗中特异性抗体的靶标。单链抗体(single chain fragment variable, scFv)是由全抗体的重链可变区和轻链可变区通过连接子结合而成的小分子抗体,单链抗体保留全抗体的亲和力和特异性,单链抗体在疾病的诊断和治疗应用中具有分子量小,免疫原性低能够作为靶向性药物传递载体的优点。鱼精蛋白(protamine)是大马哈鱼精核中的主要成分,含有很多碱性氨基酸,在基因治疗中能够有效的结合和传递DNA进入细胞内。含22个氨基酸残基的鱼精蛋白截短体(truncated protamine, tP)富含大量精氨酸,具有鱼精蛋白结合和传递DNA的能力。因此包含抗禽流感HA的单链抗体与鱼精蛋白截短体的融合蛋白作为靶向载体和抗病毒核酸药物(小干扰RNA, siRNA或反义核酸AS ODNs)结合,可以将抗病毒药物特异性的传递到病毒感染细胞或组织,用于抗禽流感病毒的治疗。方法构建含抗H5N1禽流感病毒HA的scFv基因和截短的人鱼精蛋白基因(编码22个氨基酸)的重组质粒pET28-scFv-tP,转化大肠杆菌BL21,进行融合表达获得融合蛋白scFv-tP。并对表达的蛋白进行His柱纯化、尿素梯度透析复性和Westernblot检测。进一步使用细胞ELISA试验(cell ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)检测融合蛋白对病毒HA的结合；使用凝胶阻滞试验(EMSA)检测融合蛋白对DNA的结合；使用融合蛋白介导含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的质粒或异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记寡核苷酸(ODNs)转染H5N1禽流感病毒感染的细胞,通过流式细胞仪进行检测,验证融合蛋白能否特异性的和病毒感染细胞结合；使用融合蛋白介导已报道对H5N1禽流感病毒复制具有抑制能力的siRNA (NP1496)在MDCK细胞水平上验证融合蛋白能否提高siRNA药物的抗病毒活性。进一步使用融合蛋白和前期筛选出具有较好抗病毒活性的PA492结合在MDCK细胞上通过病毒滴度检测、荧光定量PCR和间接免疫荧光试验验证融合蛋白介导PA492抑制病毒复制的能力;小鼠体内使用融合蛋白介导FITC标记的PA492尾静脉注射H5N1禽流感病毒感染的小鼠,验证融合蛋白能否介导AS ODNs特异性进入病毒感染组织。最后使用融合蛋白介导PA492治疗致死剂量H5N1病毒感染的小鼠,通过存活率、体重变化及在不同时间点的肺感染指数、肺病毒滴度、肺实质病变和病理切片的检测和观察验证融合蛋白介导P492在小鼠体内抑制病毒复制的能力。结果将禽流感病毒HA特异性的scFv基因和截短的人鱼精蛋白基因通过连接子(linker)结合,将获得的融合蛋白进行原核表达、纯化和复性,能够从1L细菌培养物中获得约6 mg、纯度约为90%的融合蛋白,复性率约为5%。细胞ELISA和间接免疫荧光试验显示融合蛋白对HA具有和单独单链抗体相似的识别和结合活性,以剂量依赖性方式和HA结合。EMSA试验显示融合蛋白能够有效结合DNA。流式细胞仪检测显示融合蛋白能介导含EGFP质粒和FITC标记的寡核苷酸特异性的传递到病毒感染的细胞表面。进一步将融合蛋白和病毒特异性的siRNA共转染MDCK细胞,显示融合蛋白介导的siRNA能够在细胞水平上提高siRNA的抗病毒效果,抑制流感病毒的复制。在融合蛋白结合反义核酸的实验中,通过病毒滴度、荧光定量PCR和间接免疫荧光试验显示融合蛋白能够提高PA492在MDCK细胞上的抗病毒活性,体内传递试验显示融合蛋白能够介导FITC标记的PA492进入禽流感病毒感染的小鼠肺部组织,小鼠体内的攻毒保护试验显示融合蛋白介导的PA492能够部分保护小鼠免受致死剂量H5N1流感病毒的攻击,保护率达62.5%,效果稍好于脂质体的介导(50%存活率)。此外,融合蛋白介导的PA492和脂质体介导的药物相比在感染小鼠体内有更低的肺感染指数和肺病毒滴度。结论这些结果显示使用含抗禽流感病毒HA的单链抗体鱼精蛋白融合蛋白具有单链抗体结合HA和鱼精蛋白结合DNA的特性,能够作为AS ODNs药物的靶向性传递系统,能够在H5N1禽流感病毒的基因治疗中作为一种有效靶向性传递工具。同时融合蛋白和反义核酸形成的靶向制剂能够有效的在感染细胞和感染小鼠体内抑制H5N1禽流感病毒的复制,用于禽流感病毒的治疗。