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背景:胆管癌约占消化系统肿瘤中的3%,近年发病率呈上升趋势,其死亡率高,5年生存率低。由于胆管癌早期症状不明显,发现多已是晚期,手术治疗效果欠佳,且缺乏有效化疗方案,故从中医中药角度寻求新的治疗方法和药物引起学者们的广泛关注。龙葵为茄科茄属植物(SolanumnigrumL),具有清解热毒、消肿散结、消炎利尿的传统中医功效。近年来龙葵对恶性肿瘤的治疗作用引起了人们的关注,被列为十大抗肿瘤中草药之一。不少研究表明龙葵中含有多种具有抗肿瘤作用的活性成分,其中澳洲茄边碱作为龙葵的主要活性成分,抗癌作用得到了肯定。但其发挥的作用机制尚不十分清楚。本课题将从细胞生物学角度探讨澳洲茄边碱对人胆管癌细胞的促进凋亡、抑制增殖和转移作用,以期解释龙葵抗胆管细胞癌的部分作用机制,并为临床应用提供理论及实验依据。目的:探讨龙葵提取物澳洲茄边碱对人胆管癌细胞的促进凋亡、抑制增殖和转移作用及其机制。方法:①采用0,2,4,6,8,10 μM浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939细胞株后,用倒置光学显微镜观察细胞数目、细胞形态的变化;MTT法检测细胞增殖抑制率,选择最佳药物作用时间及药物浓度,探讨澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞增殖的影响;②采用上述浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939后,采用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率及凋亡分布情况,观察澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞凋亡的影响;③采用上述浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939后,在JC-1染色细胞后用流式细胞术检测肿瘤细胞线粒体膜电位的变化情况;用Q-PCR检测8Bcl-2、Bcl-XL、Bax和XIAP凋亡基因的表达情况;用Western blot方法检测凋亡蛋白Bcl-2与Bax、Caspase-3、XIAP、RARP等蛋白的变化情况,探讨澳洲茄边碱诱导胆管癌QBC939细胞凋亡的作用机制;④采用上述浓度的澳洲茄边碱处理对数生长期人胆管癌细胞系QBC939后,划痕试验、Transwell检测细胞迁移及侵袭能力变化情况;Q-PCR及 Western blot 检测 EMT 相关蛋白 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 及 Snail 的 mRNA 及蛋白的表达变化,Western blot检测PI3K/AKT信号通路的表达变化,探讨澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞转移的影响及作用机制。结果:①细胞实验结果表明,澳洲茄边碱作用人胆管癌QBC939细胞后,细胞形态学观察,出现了细胞核皱缩,细胞形态不规则改变及出现凋亡小体等细胞凋亡的表现。MTT检测提示澳洲茄边碱对人胆管癌QBC939细胞具有明显的浓度依赖性抑制增殖作用,且其半抑制浓度(IC50)值为9.81μM;②流式细胞术AnnexinV-FITC和PI标记法对细胞凋亡比例的测定结果显示,澳洲茄边碱可促进人胆管癌QBC939细胞的凋亡,并呈明显的浓度依赖(尤其是浓度>6μM),细胞早晚期凋亡率均升高,以早期凋亡为主;③用JC-1染色肿瘤细胞后,流式细胞术检测显示肿瘤细胞线粒体膜电位降低。应用Western blot实验显示抑制凋亡的代表基因Bcl-2表达下调,凋亡抑制蛋白XIAP和DNA损伤修复酶PARP表达下调,而Caspase3及Caspase7表达上调,说明细胞处于凋亡状态,而Bax促凋亡基因编码的Bax蛋白增加进一步说明细胞进入凋亡状态;④划痕及Transwell试验检测提示澳洲茄边碱可抑制人胆管癌QBC939细胞迁移及侵袭,进一步检测其机制提示澳洲茄边碱可抑制PI3K/AKT信号通路表达,下调转录因子Snail,促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin和Vimentin的表达。结论:①龙葵提取物澳洲茄边碱可以抑制人胆管癌QBC939细胞增殖,并通过降低肿瘤细胞线粒体膜电位、上调促凋亡蛋白的表达并下调抑凋亡蛋白的表达诱导肿瘤细胞凋亡;②龙葵提取物澳洲茄边碱可抑制人胆管癌QBC939细胞迁移及侵袭,其机制可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路表达,下调转录因子Snail,促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin和Vimentin,从而阻断EMT过程来抑制胆管癌细胞转移和侵袭。③澳洲茄边碱能够抑制人胆管癌QBC939细胞生长及转移,提示龙葵提取物澳洲茄边碱可能是胆管癌治疗的有效药物之一。