天然低共熔溶剂是基于生物领域中细胞内细胞质组分分析和化学领域中低共熔溶剂概念的思考,提出的由生物体内小分子代谢物如胆碱衍生物、醇类、糖类、尿素等物质作为组分形成的新型溶剂。鉴于这种新型溶剂可能在自然界的广泛存在和介质功能,其作为工业催化反应介质,将有助于解决目前酶催化在工业上因环境不匹配带来的应用瓶颈,可能为生物催化反应提供一个真正合适的介质环境。本文工作主要为探索将这些天然来源的一些小分子物质形成的溶剂引入到生物催化反应中,考察这些天然低共熔溶剂的基本性质和脂肪酶在此溶剂中的表现,并初步评估了脂肪酶在这种新型溶剂和新型反应体系中进行油脂催化转化的效率和可能形式。主要研究内容为以下四个方面:一、仪器分析研究了天然低共熔溶剂基本理化性质,综合采用13C NMR、1H NMR、FT-IR、DSC/TG测试了这些溶剂的分子结构,并探讨了组分之间形成和相互作用机制。考察了水分添加对溶剂化学结构、物理性质以及与生物大分子相互作用的影响。结果发现,溶剂是组分之间主要通过氢键相互作用形成的常温下为液体的混合物;一定量的水分添加能减少溶剂内部氢键相互作用,并显著降低溶剂黏度。因此可以通过控制水分来达到提高溶剂应用效果的目的。研究初步探明了溶剂的形成机制和化学特性,并评估了水分对溶剂在应用上的可能影响。二、评估了脂肪酶在天然低共熔溶剂中的稳定性和底物选择性。结果发现,不同溶剂对脂肪酶的影响差异很大,含有机酸的溶剂可以抑制脂肪酶的活性,而在含有“渗透质”如甜菜碱、木糖醇、海藻糖等组分的溶剂中,脂肪酶能维持跟在水中相似甚至更高的活性。溶剂可以显著提高酶的热稳定性,CALB脂肪酶在甜菜碱-甘油、氯化胆碱-海藻糖和甜菜碱-木糖醇溶剂中80℃保温2 h,酶活没有明显降低。天然低共熔溶剂对脂肪酶的脂肪酸选择性有明显的影响,尤其是对短链底物的选择性。脂肪酶TL100在天然低共熔溶剂中对C4底物的选择性相对于在水中明显降低。而对于CALA脂肪酶,天然低共熔溶剂的加入可提高酶对C6底物的选择性。三、考察了天然低共熔溶剂中的酯化反应特性,通过合成两种营养功能产品1,3-甘油二酯和n-3 PUFA甘油三酯验证了溶剂作为酶催化反应介质的优势。天然低共熔溶剂的存在可以改变脂肪酶催化反应过程中的底物选择性。1)氯化胆碱的存在有利于甘油酯化反应中甘油二酯尤其是1,3-甘油二酯的积累。在含氯化胆碱的溶剂体系中,脂肪酶Novozym 435催化酯化反应1 h即可获得42.9%的1,3-甘油二酯(56.7 wt%)。2)溶剂的存在,尤其是尿素组分的存在有利于酯化反应中甘油三酯的积累。在氯化胆碱-尿素(1:1)溶剂体系中,脂肪酶Novozym 435催化酯化55℃条件下反应12 h,n-3PUFA甘油三酯含量达到55.03 wt%。四、探索了天然低共熔溶剂中的脂肪酶催化水解反应的可能模式。以天然低共熔溶剂溶剂组分氯化胆碱和甜菜碱为基础,建立新型的双水相体系。评估了此体系分离蛋白的能力和萃取分离机制,并以此为基础形成了新的应用于油脂水解的反应体系。在甜菜碱/K2HPO4双水相中牛血清蛋白的萃取效率超过90%,同时为蛋白质提供了一个温和而稳定的环境。考察了季铵盐双水相中4种常见的商品化脂肪酶(CALB、CALA、TL100和AYS)的蛋白分配和酶活分配情况。建立了以种季铵盐双水相为基础的酶促水解反应体系。脂肪酶AYS催化水解橄榄油反应中,水解反应3 h后游离脂肪酸含量达到91.44%。