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在长期的生物进化过程中,从酵母的单倍体交配型进化到纤毛虫多样化的交配型细胞,以及高等生物两性配子细胞结合的生殖方式,细胞为彼此识别融合进化出精细的调控系统。单细胞真核生物有性生殖起始于不同交配型细胞的识别结合,不同的调控因子及细胞膜表面蛋白直接参与,起始了有性生殖进程。原生动物嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）具有7种不同的配对型,不同交配型细胞通过有性生殖过程中基因重排机制随机产生。不同交配型细胞间识别配对时,细胞形态发生改变,配对细胞形成稳定的conjugation junction结构,小核经历连续两次减数分裂,配子交换融合。目前四膜虫细胞性别决定和减数分裂机制取得重要进展,然而细胞识别的分子机制并不清楚。本研究鉴定了饥饿诱导的阶段性特异表达的周期蛋白基因CYC9,并对周期蛋白Cyc9p相关蛋白在细胞配对起始过程中的功能进行了系统分析。获得的主要结果如下:1.CYC9在饥饿期和有性生殖期特异表达通过四膜虫大核基因组数据库（http//:www.ciliate.org）以及功能基因组数据库（http://tfgd.ihb.ac.cn）对嗜热四膜虫CYC9（TTHERM00940290）基因进行分析发现,该基因全长为1915bp,开放阅读框为1218bp,预测编码405个氨基酸,蛋白大小约为45KDa。Cyc9氨基酸序列比对分析发现其中含有一段由95aa组成的保守的周期蛋白框,但没有典型的破坏框,N端有一段富含赖氨酸的区域,推测为泛素化结合位点。Microarray表达谱及qRT-PCR分析表明CYC9基因在生长期不表达,在饥饿期和细胞配对初期具有高表达。通过构建带有HA标签的由MTT1启动子调控表达的重组质粒pXS75CYC9,将该质粒转入野生型细胞株后进行免疫荧光定位分析,发现Cyc9p定位在细胞质中。2.CYC9敲除抑制不同交配型细胞的识别配对构建质粒pNeo4-CYC9,转化不同交配型的嗜热四膜虫细胞B2086和Cu428,通过Paromomycin抗性筛选和表型分配,获得CYC9敲除突变细胞株ΔCYC9-B和ΔCYC9-C。对ΔCYC9突变细胞株进行不同交配型细胞识别配对分析,结果表明不同配对型敲除突变细胞株之间不能发生配对结合。进一步对ΔCYC9突变株细胞形态进行观察发现,饥饿诱导的不同配对型突变细胞株混合后,其细胞形态始终与饥饿时相同,并不被诱导出现细胞极性突出结构。构建pBsrCYC9重组质粒,转化ΔCYC9-B和ΔCYC9-C突变株,恢复CYC9的表达。结果发现营救之后部分细胞可以恢复配对,且配对细胞可以正常完成有性生殖发育,表明CYC9为细胞的识别配对所必需。3.CYC9相关基因的鉴定分析对野生型和ΔCYC9突变细胞株总RNA进行差异转录组分析,结果发现CYC9的表达缺失导致嗜热四膜虫性别决定基因MTA6表达量下降了约10倍,MTB6表达量下降了约20倍。此外,编码周期蛋白依赖性蛋白激酶催化亚基的基因CKS1表达量下降了约25倍。为进一步了解周期蛋白Cyc9p调控通路参与的因子及其功能,通过功能基因组数据库（http://tfgd.ihb.ac.cn）鉴定了与CYC9共表达的周期蛋白依赖性激酶基因CDK19。4.CYC9相关基因CDK19,CKS1敲除干扰细胞识别配对分别构建敲除质粒pNeo4CDK19和pNeo4CKS1,转化不同交配型的嗜热四膜虫细胞Cu427和Cu428,通过Paromomycin抗性筛选和表型分配,获得CDK19和CKS1敲除突变体细胞。将不同交配型CDK19敲除突变细胞株进行配对观察,结果发现,敲除CDK19后细胞不能进行配对;将不同配对型的CKS1敲减突变株进行配对发现,CKS1基因敲减后细胞的配对率仅达到20%-30%,表明Cdk19和Cks1共同参与调控交配型细胞的配对识别。本研究首次对嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC9及其相关因子的功能进行了分析,CYC9基因在生长期不表达,在饥饿期和有性生殖细胞配对初期具有高表达,Cyc9p定位在细胞质中。CYC9,CKS1,CDK19为嗜热四膜虫不同交配型细胞的识别和配对所必需,CYC9的敲除同时抑制了四膜虫性别决定基因MTA6和MTB6的表达。结果表明周期蛋白Cyc9及相关因子Cdk19,Cks1共同参与调控嗜热四膜虫有性生殖过程中细胞的识别配对。