刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫，呈世界性分布。人群感染极为普遍，许多国家和地区的感染率达25％～50％。正常人群感染弓形虫后一般没有明显的临床症状，但在免疫功能低下的肿瘤患者、器官移植接受者和艾滋病患者等特殊人群，感染的虫体可以大量增殖，引起全身播散性损害，成为患者死亡的重要原因之一。妇女在怀孕期间感染T．gondii，可将其垂直传播给胎儿，造成流产、早产、死胎和畸形等，存活的胎儿也往往有严重的后遗症。弓形虫病又是一种人兽共患病，其暴发流行对畜牧业造成极大的损失。目前弓形虫病的治疗并无特效药物，传统的乙胺嘧啶和磺胺嘧啶因在长期使用中表现的毒副作用使其应用受到限制。 研究目的和意义： 有多个分子参与了弓形虫入侵宿主细胞的过程，如Ca2+、三种微线体复合体(MIC6-MIC1-MIC4、MIC2-M2AP和MIC3-MIC8)、棒状体蛋白和肌动蛋白等。其中微线体复合体和肌动蛋白发挥着重要的作用，微线体复合体依靠其独特的黏附结构域识别、黏附宿主细胞，肌动蛋白为入侵提供动力支持。已有研究证实弓形虫的醛缩酶与MIC2-M2AP复合体中的跨膜蛋白MIC2的C端片段相互作用，将入侵识别蛋白MIC2-M2AP复合体和动力蛋白肌动蛋白相连接，从而阐明了弓形虫入侵相关分子MIC2-M2AP复合体参与虫体入侵的模式。MIC6-MIC1-MIC4微线体复合体在虫体入侵过程中同样发挥着重要作用，该复合体中的跨膜蛋白MIC6是由何种蛋白介导与动力系统的连接，目前却未见相关的研究报道。本研究的目的旨在筛选并鉴定与TgMIC6蛋白C端相互作用的蛋白，探讨在MIC6-MIC1-MIC4微线体复合体和肌动蛋白之间起桥梁作用的蛋白，阐明MIC6-MIC1-MIC4复合体参与虫体入侵的模式，为进一步研究T．gondii的入侵机制奠定基础；同时，T．gondii作为一模式生物，它的入侵机制的研究可以为顶复门其它寄生原虫的研究提供参考。 研究方法： 1、GST—MIC6C蛋白及其多克隆抗体的制备 以弓形虫的cDNA为模板，PCR扩增MIC6C基因片段；构建MIC6C/pGEX—4T-1重组质粒，IPTG诱导表达融合蛋白GST—MIC6C；亲和层析纯化融合蛋白，核酸蛋白仪分析蛋白浓度。融合蛋白GST—MIC6C皮内多点注射免疫动物(新西兰兔和SD大鼠)，收集抗血清，亲和层析纯化，制备GST—MIC6C多克隆抗体。 2、筛选并鉴定与MIC6C作用的蛋白 制备弓形虫速殖子裂解液；以GST—MIC6C为探针蛋白、GST为对照蛋白，采用GST沉降技术从弓形虫速殖子裂解液中筛选蛋白，SDS—PAGE分析，蛋白条带N端测序，BLAST2在线相似搜索，初步确定蛋白。构建Aldolase/pET30a重组原核表达系统，诱导表达重组蛋白；亲和层析纯化；重组蛋白免疫动物，收集抗血清并纯化，棋盘滴定法测定纯化的Aldolase—His多克隆抗体的效价。相同方法制备Actin—His蛋白及其多克隆抗体。用大鼠源性Aldolase—His多克隆抗体和Actin—His多克隆抗体作为一抗，兔抗大鼠IgG—HRP为二抗，Western blot分析GST沉降初筛产物，ECM法检测。 用兔源性GST—MIC6C多克隆抗体包被protein G sepharose，兔免疫前血清为对照，与速殖子裂解液进行免疫共沉淀实验，SDS—PAGE分析；分别以大鼠源性GST—MIC6C多克隆抗体、Aldolase—His多克隆抗体和Aldolase—His多克隆抗体为一抗，兔抗大鼠IgG—HRP为二抗，Western blot分析免疫共沉淀产物，ECM法检测。 制备GST—aldolase蛋白，与Actin—His蛋白液进行GST沉降实验。 3、MIC6C与Aldolase的作用位点及其在虫体内的定位 设计MIC6C W/V突变体基因扩增用引物，PCR扩增MIC6C W/V突变体基因；构建MIC6C W/V/pGEX—4T-1重组载体，诱导表达GST—MIC6C W/V突变体蛋白，亲和层析纯化蛋白。以GST—MIC6C蛋白为阳性对照，GST—MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白与速殖子裂解液进行GST沉降实验，SDS—PAGE；分别以大鼠源性Aldolase—His多克隆抗体和Actin—His多克隆抗体作为一抗，兔抗大鼠IgG—HRP为二抗，Western blot分析GST沉降产物。相同方法制备GST—MIC2C蛋白及其多克隆抗体；制备GST—MIC2C W/A突变体蛋白。以GST—MIC2C蛋白和GST—MIC2C W/A突变体蛋白为阳性对照，GST—MIC6C蛋白和GST—MIC6CW/V突变体蛋白为探针蛋白分别与速殖子裂解液进行GST沉降实验，SDS—PAGE分析。 制备弓形虫速殖子涂片，常规固定、封闭；用兔源性GST—MIC6C多克隆抗体和鼠源性aldolase—His多克隆抗体作为一抗，先用羊抗兔IgG—TRITC荧光二抗进行温育，再用兔抗大鼠IgG—FITC荧光二抗温育，荧光显微镜下观察并拍照，图像分析软件分析。一抗采为兔源性GST—MIC2C多克隆抗体和鼠源性aldolase—His多克隆抗体，相同方法对MIC2和Aldolase进行间接免疫荧光定位。 研究结果： 1、GST—MIC6C蛋白及其多克隆抗体的制备 成功构建了MIC6C/pGEX—4T-1重组质粒，并诱导表达了目的蛋白；亲和层析法纯化融合蛋白GST—MIC6C，核酸蛋白仪分析其浓度为3.23mg/ml。用GST—MIC6C蛋白分别皮内多点注射免疫新西兰兔和SD大鼠，收集抗血清，亲和层析法纯化抗体，棋盘滴定法测定兔源性GST—MIC6C多克隆抗体的效价为1:8000，大鼠源性GST—MIC6C多克隆抗体的效价为1:4000。 2、筛选并鉴定与MIC6C作用的蛋白 GST—MIC6C与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验产物中有蛋白条带，而以GST为对照蛋白的GST沉降实验产物中没有相应的蛋白条带。蛋白N端测序结果经BLAST2在线相似搜索，与醛缩酶(aldolase)蛋白的N端序列完全一致。成功构建了Aldolase/pET30a和Actin/pET30a原核表达系统，诱导表达并纯化，获得了纯化的重组蛋白。Aldolase—His蛋白浓度为7.28mg/ml；Actin—His蛋白浓度为0.35mg/ml。重组蛋白的多克隆抗体效价为1:4000。用大鼠源性Aldolase—His多克隆抗体和Actin—His多克隆抗体作为一抗，兔抗大鼠IgG—HRP为二抗，Western blot分析GST沉降初筛产物，X—感光胶片显示GST—MIC6C与弓形虫速殖子裂解液GST沉降产物中有蛋白条带可分别被上述一抗识别。 GST—MIC6C多克隆抗体包被的protein G sepharose与弓形虫裂解液的免疫共沉淀产物中有蛋白条带可分别被GST—MIC6C抗体、Aldolase—His抗体和Actin—His抗体识别，而在免疫前血清的免疫共沉淀产物中却没有可以识别的蛋白条带。 以GST—aldolase为探针蛋白与Actin—His蛋白液的GST沉降产物中有蛋白条带，且大小与Actin—His相符，而GST对照蛋白的GST沉降产物中则没有蛋白条带。 3、MIC6C与Aldolase的作用位点及其在虫体内的定位 获得了GST—MIC6CW/V突变体蛋白，蛋白浓度为1.78mg/ml。GST—MIC6CW/V蛋白与速殖子裂解液的GST沉降产物中没有蛋白条带。Western blot显示在GST—MIC6C的GST沉降产物中有蛋白条带可分别被特异的一抗所识别，而GST—MIC6CW/V蛋白的产物中则没有。制备了GST—MIC2C、GST—MIC2CW/A蛋白和GST—MIC2C多克隆抗体，蛋白浓度分别为3.07mg/ml和2.55mg/ml。抗体的效价为1:8000。GST—MIC6C和GST—MIC2C蛋白分别与速殖子裂解液的GST沉降产物中可见蛋白条带，而GST—MIC6CW/V和GST—MIC2CW/A突变体蛋白的GST沉降产物中则没有目的条带。 间接免疫荧光定位显示：MIC6(红色荧光)和Aldolase(绿色荧光)共同定位于弓形虫的顶端，与阳性对照MIC2(红色荧光)相一致。 研究结论： GST沉降实验和免疫共沉淀实验的结果及蛋白在虫体内的间接免疫荧光定位都证明醛缩酶是与MIC6蛋白C端相互作用的蛋白。即醛缩酶介导TgMIC6与肌动蛋白的连接。因此，MIC6-MIC1-MIC4微线体复合体参与入侵的模式为：复合体—醛缩酶—肌动蛋白。氨基酸点突变后蛋白质相互作用实验揭示MIC6蛋白C端的色氨酸为相互作用的关键氨基酸残基。