论文部分内容阅读
有机磷类农药具有广谱、高效的杀虫特点,在我国农业生产中有着较为广泛的应用,占我国农药使用总量的一半以上。但有机磷类农药的高毒性以及环境污染与累积毒性的风险,使之成为我国危害人类健康、食品安全监管的重要化学物质。近年来,随着基因工程技术的发展,特别是多肽、噬菌体展示技术的应用,针对农药小分子制备表位多肽、抗体及抗独特型抗体,建立无毒无害、绿色的检测方法有了长足的发展。目前,针对农药的抗独特型抗体,及利用噬菌体技术筛选毒素的抗独特型抗体,建立无毒无害的检测方法均有报道。而针对具有累积毒性风险的有机磷农药的绿色检测方法的研究较少,具有相同毒性机理的家族类农药的累积风险是严重影响人类健康的隐含问题,急需绿色的快速检测方法。本研究利用噬菌体展示技术,得到有机磷类农药通用结构(BPB)的多肽,使其模拟BPB的抗原表位,建立了针对有机磷类农药的无毒ELISA检测方法,同时利用人源单域抗体库技术,对广谱识别有机磷农药的抗体进行了筛选;本文主要研究内容:1.抗原与抗体的制备及鉴定。抗体材料为两株能够识别8-15种有机磷农药的广谱型小鼠单克隆抗体细胞株,分别为BPB-BSA(牛血清蛋白)单抗细胞株及BPB-KLH(匙孔血蓝蛋白)单抗细胞株。对其进行细胞的复苏、细胞株的扩大培养以及细胞制备腹水。经过辛酸-硫酸铵法初步纯化后,用Protean G柱纯化,SDS-PAGE估计抗体纯度。结果证明纯化效果明显,间接竞争ELISA表明抗体灵敏度与活性均较好。抗原材料为BPB偶联的氨基化磁珠以及前人偶联鉴定完成的抗原BPB-BSA。2.利用噬菌体展示十二肽库筛选识别及模拟抗原表位多肽。本研究完成了抗原BPB-BSA淘选有机磷类农药特异性识别多肽、BPB-BSA单抗淘选模拟抗原表位多肽以及BPB-KLH单抗淘选模拟抗原表位多肽。研究进行了一系列噬菌体扩增、纯化和ELISA鉴定步骤,最终在BPB-KLH单抗淘选模拟抗原表位多肽研究中成功得到五株阳性克隆。结果表明,阳性噬菌体克隆多肽氨基酸序列为HPAPDHSSQSHQ。氨基酸序列模拟BPB抗原表位,位于外源片段N端第3-10个氨基酸区域的抗原指数最高,可形成?转角,其表面可及性指数和亲水性指数均大于零,氨基酸的抗原表位极有可能在此区间。3.利用单域抗体库筛选抗独特型抗体和特异性识别抗体。完成BPB偶联氨基化磁珠淘选单域抗体和BPB-KLH单抗淘选抗独特型抗体,实验均能够筛选到特异性结合靶分子的噬菌体,但均没有竞争效果,有待进一步的研究。4.基于BPB-KLH单抗淘选模拟抗原表位的多肽的间接竞争ELISA方法的建立。结果表明,针对BPB的检测中,其IC50和最低检测限分别为为1.776μg/ml及0.358μg/ml。与对硫磷、蝇毒磷、乙拌磷、辛硫磷、喹硫磷和三唑磷的交叉反应率分别为58.74%、44.93%、52.03%、43.98%、36.82%。和4.87%。