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狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的人畜共患传染病,人和动物一旦发病,死亡率几乎是100%。在世界大多数地区,狂犬病仍然是一个重要的公共安全问题,每年至少有59000人死于狂犬病,严重威胁人类的健康安全,给人们带来了沉重的心理负担。发达国家已经通过大规模接种疫苗基本控制了人类狂犬病的蔓延,而发展中国家人类狂犬病的发生仍旧普遍。几乎所有的（99%）人类狂犬病的死亡由犬咬所致,因此我们迫切需要一个廉价有效的疫苗来控制或消除发展中国家由犬介导的狂犬病。目前,狂犬病疫苗的研究多种多样,但开发RABV弱毒活疫苗和重组活载体疫苗是控制或治疗狂犬病最具有潜力的方法。高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一个高度保守的非组蛋白染色体蛋白,促进树突状细胞的成熟,介导非感染性炎症反应中的免疫反应。趋化因子CXCL13招募滤泡辅助性T细胞和B淋巴细胞到达二级淋巴器官,有助于二级淋巴器官中B淋巴滤泡的形成和发育。我们以前的研究表明,过表达细胞因子或趋化因子,如巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）或巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP-1α）等,能够增强RABV弱毒活疫苗的免疫原性。延续这一思路,为了获得更加高效的RABV弱毒活疫苗,我们选定了HMGB1和CXCL13这两个分子进行RABV弱毒活疫苗的开发,并研究其作用机制。本论文中,我们主要开展了以下两项研究:在第一项研究中,我们将鼠源HMGB1的两个核定位序列中的所有丝氨酸突变成丙氨酸,在序列前面融合分泌型信号肽序列,使其不能够进入细胞核而分泌到细胞外,从而构建突变型HMGB1(HMGB1mut)。然后,将HMGB1mut插入到RABV弱毒株LBNSE的基因组中,并拯救重组RABV,研究HMGB1mut对RABV免疫原性的影响及其机制。间接免疫荧光（IFA）和蛋白免疫印迹（Western blotting）结果表明,LBNSE-HMGB1mut成功表达HMGB1mut,并分泌到培养基上清中。有意思的是,野生型HMGB1（HMGB1wt）和HMGB1mut均能够轻微抑制RABV在BSR和NA细胞中的复制（滴度下降0.5 Log FFU/ml）,HMGB1wt和HMGB1mut的表达抑制了RABV诱导的细胞凋亡,而对细胞活性没有影响。体外实验表明,HMGB1mut能够显著促进骨髓源树突状细胞的成熟;体内实验表明,LBNSE-HMGB1mut能够显著招募和/或成熟小鼠体内的树突状细胞,从而增加滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞以及浆细胞的数量。进一步研究发现,免疫LBNSE-HMGB1mut的小鼠比免疫LBNSE和免疫LBNSE-HMGB1wt的小鼠产生更多的RABV中和抗体（VNA）,并提供机体更好的保护,且对小鼠没有明显的危害作用。总之,这些发现使我们更好地理解HMGB1mut在RABV诱导的体液免疫反应中的作用,有助于开发更加高效的RABV疫苗。该研究首次在重组活病毒疫苗中证实HMGB1在不明显影响病毒复制的情况下促进病毒诱导的体液免疫反应,为未来RABV疫苗的开发奠定一定基础。在第二项研究中,我们将鼠源趋化因子CXCL13插入到RABV弱毒株LBNSE的基因组中,并拯救重组RABV,研究CXCL13对RABV免疫原性的影响及其机制。通过ELISA鉴定了CXCL13的表达。体外和体内实验表明,CXCL13的表达并没有影响病毒的生长特性。LBNSE-CXCL13表达的CXCL13在体外和体内均具有生物学活性,都能够招募表达其受体CXCR5的细胞。进一步研究表明,过表达CXCL13促进了引流淋巴结的生长发育和生发中心的形成。表达CXCL13的重组RABV弱毒活疫苗比亲本病毒LBNSE和LBNSE-GM-CSF诱导机体产生更多的GC B细胞,进而激活更多的浆细胞,提升VNA滴度,并提供机体更好的保护。此外,CXCL13的血浆浓度、RABV VNA滴度和GC活性三者之间极显著正相关,CXCL13是检测RABV诱导的体液免疫反应的一个血浆标志。总之,CXCL13是一个有潜力的RABV佐剂分子,可以通过血浆CXCL13的浓度间接评判RABV疫苗的免疫效果。结合我们之前的研究,我们发现了CXCL13不同于以往的促进RABV诱导的体液免疫反应的机制,即CXCL13不能够促进DCs的成熟,通过招募滤泡辅助性T细胞和B细胞,激活更多的GC B细胞,进而激活更多的浆细胞,从而促进了机体的体液免疫反应,该研究为新型RABV疫苗的开发奠定了理论基础,提供了新思路。