前言经皮冠状动脉腔内介入(percutaneous coronary intervention, PCI)术是目前治疗冠心病最有效的手段之一,但PCI术后3到6个月内血管重建部位再狭窄(restenosis,RS)的发生在一定程度上限制了其应用。大量研究表明,RS的发生是一个多因子参与的复杂病理过程,其中包括血管弹性回缩、血小板黏附聚集及血栓形成、新生内膜形成等多个环节。其中主要机制是血管损伤局部中膜平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)过度增殖,向内膜迁移及细胞外基质形成引起的内膜增生。因此寻找有效的手段抑制SMC增殖和迁移对临床预防RS具有重要的指导意义。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是细胞外基质中一种重要的功能性蛋白,差异显示技术证明OPN是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型转化的标志基因,其表达决定了VSMC的表型。多项研究表明,OPN在血管损伤后新生内膜中的表达明显上调,而且它能促进VSMC和外膜细胞的增殖、迁移,被认为是血管损伤修复过程中重要的始动因素。尽管OPN在促进VSMC增殖的过程中起着重要的作用,但其具体机制研究尚少。本课题拟通过初步探讨OPN反义核苷酸对大鼠血管SMC增殖的影响及其机制,进而为OPN作为防治RS的新靶点提供理论基础和实验依据。材料和方法一、大鼠A10主动脉VSMC的培养用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养大鼠A10主动脉平滑肌细胞。用0.25%胰酶消化、传代。传代以后使用含10% FBS、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素,pH7.4的DMEM维持细胞生长,2～3天换液一次,选取3～8代细胞进行实验。二、OPN反义核苷酸的转染委托Takara公司合成OPN反义核苷酸,并应用转染试剂FuGENE6对VSMC进行瞬时转染。操作步骤严格按转染试剂FuGENE6使用说明书进行。三、实验方法MTT比色法测定OPN反义核苷酸转染对VSMC增殖的影响；FCM分析OPN反义核苷酸转染对VSMC细胞周期分布的影响；RT-PCR检测OPNmRNA、PCNAmRNA;四、统计学分析采用SPSS11.0统计软件进行数据分析。One-way ANOVA分析不同组间参数比较,两两比较采用LSD方法。p<0.05为统计学上有显著性差异。实验结果1、MTT结果显示：OPN反义核苷酸转染24、48、72h后,细胞增殖抑制率分别为24%、19.6%、17%,与对照组相比,有明显差异(p<0.05),说明OPN反义核苷酸对VSMC的增殖有明显的抑制作用,并且随时间延长对细胞增殖抑制率下降。2、FCM分析显示：OPN反义核苷酸主要作用于G1／S限制点,能阻止VSMC由G0／G1期向S期推进,从而将VSMC阻滞于G0／G1期,抑制VSMC的增殖。3、RT-PCR结果显示：VSMC转染OPN反义核苷酸后,PCNAmRNA的表达水平较对照组降低(p<0.05)。结论大鼠VSMC中,转染OPN反义核苷酸可以抑制VSMC的增殖,其机制可能为转染OPN反义核苷酸能够阻止VSMC由G0／G1期向S期推进,从而将VSMC阻滞于G0／G1期,抑制VSMC的增殖。