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目的：PIAS3是蛋白质SUMO化修饰过程中的连接酶，在SUMO化过程中起着重要的作用。前期预实验结果表明，脑缺血再灌注损伤可以升高PIAS3酪氨酸磷酸化水平，提示Src家族激酶可能调控PIAS3酪氨酸磷酸化。因此，本实验在细胞水平验证Src介导PIAS3的酪氨酸磷酸化，并进一步研究PIAS3酪氨酸磷酸化的功能。 方法：本实验采用分子克隆技术分别构建野生型的PIAS3、缺失结构域的PIAS3、酪氨酸位点突变的PIAS3的真核表达载体；采用免疫沉淀、免疫印迹等方法，检测PIAS3及其突变体的酪氨酸磷酸化；采用免疫沉淀等方法，检测PIAS3与Src的相互作用。 结果：1.在HEK293细胞中分别表达Myc-PIAS3、共表达Myc-PIAS3与失活的Src激酶、共表达Myc-PIAS3与活化Src激酶后，检测PIAS3酪氨酸磷酸化，结果表明共表达活化Src激酶组中的PIAS3酪氨酸磷酸化水平明显升高。2.在HEK293细胞中分别共表达活化的Src激酶和Myc-PIAS3、Myc-PIAS3(1-500)(代表PIAS3的N端1-500氨基酸)、Myc-PIAS3(1-320)(代表PIAS3的N端1-320氨基酸)，结果表明活化的Src激酶均可以使PIAS3、PIAS3(1-500)、PIAS3(1-320)酪氨酸磷酸化。3.在HEK293细胞中分别共表达活化Src激酶和Myc-PIAS3、Myc-PIAS3 Y61F(代表将PIAS3第61位酪氨酸突变成苯丙氨酸)、Myc-PIAS3Y225F(代表将PIAS3第225位酪氨酸突变成苯丙氨酸)，Myc-PIAS3 Y270F(代表将PIAS3第270位酪氨酸突变成苯丙氨酸)，Myc-PIAS3 Y275F(代表将PIAS3第275位酪氨酸突变成苯丙氨酸)，结果表明Myc-PIAS3 Y270F突变体组中的酪氨磷酸化水平明显低于其他各组。4.在HEK293细胞中分别共表达HA-SUMO1-GG(代表带有HA标签的活化型的SUMO1)和不同梯度浓度的Myc-PIAS3、Myc-PIAS3 Y270D(代表将PIAS3第270位酪氨酸突变成天冬氨酸)，检测细胞内蛋白质的SUMO化水平，结果表明Myc-PIAS3 Y270D组中底物蛋白整体的SUMO化水平明显低于Myc-PIAS3组。 结论：1.Src激酶参与介导PIAS3酪氨酸磷酸化修饰；2.Src介导PIAS3酪氨酸磷酸化的位点主要在270位；3.PIAS3酪氨酸磷酸化后降低其SUMO化连接酶活性。