郁金作为典型的多基原中药,《中国药典》2015年版记载为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、姜黄Curcuma longa L.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.的干燥块根,前两者分别习称“温郁金”和“黄丝郁金”,其余按性状不同习称“桂郁金”或“绿丝郁金”。本课题在国家中药标准化项目以及省、市课题的支持下,以郁金饮片分级标准欠缺为切入点,深入探讨郁金饮片分级方法,为优质有效、质量可控的郁金饮片生产提供研究基础;以郁金不同炮制品作用差异为切入点,结合传统用药方式——汤剂,建立气滞血瘀模型,研究郁金醋炙、酒炙的科学性以及“醋炙入肝,增强疏肝止痛;酒炙增强活血化瘀”炮制机理。目的:通过文献、市场和临床调研,传统分级与现代科学内涵相融合,建立不同于药材按基原分级的郁金饮片分级方法,实现郁金饮片质量可控,保证临床疗效,为优质郁金饮片生产、临床合理调剂、多基原饮片分级提供参考。通过比较生郁金、醋郁金和酒郁金化学成分差异,以及对气滞血瘀模型大鼠“疏肝止痛”和“活血化瘀”功效相关药效指标、血浆内源性代谢产物的作用差异,探讨郁金醋炙、酒炙的科学性及其炮制作用机理,为中医临床选用恰当炮制品提供实验依据。方法:1.对郁金进行文献整理和市场调查,了解郁金用药历史、炮制方法及意图、质量评价体系现状等。收集169批郁金饮片,以文献、临床、传统经验和药材分级方法为参考,结合现代技术分析郁金饮片内在成分,建立传统与现代技术相统一的郁金饮片分级方法。2.立足传统用药方式,对比郁金不同炮制品出膏率以及特征成分的含量变化,并采用UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS技术研究不同炮制方法对郁金水煎液和挥发油化学成分影响,从化学层面探讨郁金炮制机理。3.紧密结合郁金“醋炙引药入肝,增强疏肝止痛作用;酒炙增强活血化瘀作用”炮制理论,采用HE染色、酶联免疫、蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR、流式检测等方法,考察生郁金、醋郁金和酒郁金对气滞血瘀证候模型“疏肝止痛”和“活血化瘀”功效相关药效指标影响,从药效层面探讨郁金炮制机理。4.应用GC-MS研究气滞血瘀大鼠模型血浆整体代谢产物变化,利用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别式分析(PLS-DA)方法分析筛选潜在生物标志物,并探讨生郁金、醋郁金和酒郁金对潜在生物标志物影响,使用Metaboanalyst构建分析相关代谢通路,基于代谢组学探讨郁金炮制机理。结果:1.郁金历来以黄丝郁金质量最优,为地道药材。其炮制工艺多样,目前主要是生用、醋炙或酒炙,也有部分地区使用清炒。本研究结合中医临床疗效,参考药材分级方法,在明确原料药材产地和炮制加工方法基础上,建立郁金饮片传统分级方法;同时在充分尊重和传承传统分级方法的基础上,加入现代评价指标(浸出物、挥发油、姜黄素类成分、吉马酮),将郁金饮片分为选货与统货,选货再进行三级划分(优级、一级和二级),形成传统与现代相结合的郁金饮片分级方法。2.经醋炙或酒炙后,黄丝郁金出膏率和姜黄素类成分含量增加。UPLC-QTOF/MS表明酒炙或醋炙后姜黄素类成分及其13个降解产物和酰胺类化合物含量较生品有较显著的提高;醋炙品中香草基乙二醇、3-(4-hydroxyphenyl)propane-1,2-diol、4,5-dihydroxy-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-oxohexanoic acid、3-(3,4-dimethoxyphenyl)propane-1,2-diol相对提升更明显;酒炙品中4,5-dihydroxy-4-methylcyclohex-2-en-1-yl)hexan-3-one更加明显;4-(4-羟基-3-甲氧苯基)-3-丁烯-2-酮、Bisacurone族等化合物炮制后下降较为明显。GC-MS表明黄丝郁金及其炮制品共有成分78种,醋炙后新增19种成分,13种成分消失,独有成分11种;酒炙后新增16种成分,14种成分消失,独有成分8种;经PCA及OPLS-DA鉴定了α-柏木烯等11个黄丝郁金及其炮制品挥发油潜在差异化合物。3.采用复合因素成功复制气滞血瘀大鼠模型。检测指标结果显示:(1)脏器变化:模型大鼠脑和肾脏的脏器指数显著升高(P<0.05),肝、心、肺的脏器指数极显著升高(P<0.01)。给药后,生黄丝郁金组(SHG)对心脏的脏器指数有显著影响,醋黄丝郁金组(CHG)和酒黄丝郁金组(JHG)对肝脏的脏器指数有极显著影响(P<0.01)。脏脑比系数中,模型大鼠心和肺的脏脑比系数极显著升高(P<0.01),给药后有回调作用,但无显著性意义。模型大鼠肺和肝脏肉眼可见明显瘀点或瘀斑;脑和肝脏的病理形态学检查出现不同程度损伤,黄丝郁金及其炮制品可以抑制肝损伤,但对脑组织病理改变不显著。给药各组间均无显著差异。(2)肝功检测发现模型大鼠出现肝脏功能性损伤,SHG对DBiL、TBiL和TBA有显著影响,CHG对ALT、DBiL、TBiL和TBA有显著影响,JHG对DBiL和TBA有显著影响。与SHG相比,CHG能显著降低ALT水平。(3)模型大鼠血浆和脑组织中β-EP含量均极显著下降(P<0.01),SHG和JHG对脑组织β-EP有显著影响,CHG对血浆和脑组织β-EP均有显著影响,JHG与SHG相比脑组织β-EP差异显著;免疫组织化学法结果显示,模型大鼠脑组织c-fos蛋白含量明显升高(P<0.01),SHG、CHG和JHG均对其有极显著影响(P<0.01),给药组间无显著差异。(4)模型大鼠血液中GAS、MLT、E2、T3和T4升高(P<0.01),Cor、TSH和NA降低(P<0.01)。SHG对E2、T3、T4和血浆中NA有显著作用。CHG对MLT、E2、T3、T4、TSH和血浆中NA有显著作用,JSH对T3、T4和TSH有显著作用,给药组间无显著差异。(5)模型大鼠血浆vWF、ET-1、TXA 2、TXB 2、5-HT、cAMP、cGMP、CD62p表达、Epo以及EpoR mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01),NO、NOS、PGI 2、6-keto-PGF1α、PGI2/TXA 2和6-keto-PGF1α/TXB 2极显著降低(P<0.01)。给药后出现不同程度回调,SHG对vWF、NOS、5-HT、Epo和EpoR蛋白表达有显著影响,CHG对NOS、5-HT、Epo和EpoR蛋白表达有显著影响,JHG对NO、NOS、5-HT、PGI 2、PGI2/TXA 2、6-keto-PGF1α/TXB 2、CD62p、Epo以及EpoR mRNA和蛋白表达有显著影响,给药组间均无显著差异。4.筛选得到16个与气滞血瘀相关潜在生物标志物,其中十八烷酸和二十二碳六烯酸显著降低,L-丙氨酸、乳酸、乙醇酸、L-亮氨酸、3-羟基丁酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸、苹果酸、苯丙氨酸、柠檬酸、肌醇、花生四烯酸和胆固醇明显升高,这些标志物主要涉及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,乙醛酸及二羧酸代谢,苯丙氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,花生四烯酸代谢以及肌醇磷酸代谢等多条代谢通路。给药后对L-丙氨酸、乳酸、3-羟基丁酸、柠檬酸、花生四烯酸和胆固醇有显著性影响,主要涉及花生四烯酸代谢和乙醛酸及二羧酸代谢等代谢通路。其中黄丝郁金生品仅对花生四烯酸有显著影响,酒炙后对乳酸、柠檬酸和花生四烯酸有显著影响,醋炙后对乳酸和花生四烯酸有显著影响。组间比较,酒炙后与黄丝郁金生品相比,对柠檬酸有显著差异。结论:1.传统的药材分级方法多以基原单独进行划分,不利于郁金饮片临床调剂和优质郁金饮片突出。本研究全面收集郁金饮片,传统与现代相结合,以临床疗效为主导,突出饮片商品属性为主要切入点,建立了不同于现有按基原分级的郁金饮片分级方法,为郁金饮片优质优价和临床合理调剂提供技术支撑,促进优质郁金饮片开发,保证临床用药的安全、有效,也为多基原饮片分级研究提供思路。2.通过对生品、醋炙品和酒炙品的水煎液出膏率、指标性成分含量、水煎液整体化学成分以及挥发油成分进行阐述,从化学层面分析郁金不同炮制品的物质差异,探讨郁金“醋炙引药入肝,增强疏肝止痛作用;酒炙增强活血化瘀作用”的物质基础。3.黄丝郁金对气滞血瘀模型大鼠的肝脏功能性损伤、神经-内分泌-免疫网络紊乱、血管内皮功能损伤、血小板活化及凝集等均有较好效果,证实了郁金善疏肝行气以解郁,活血化瘀以止痛的作用。醋炙后可增强对ALT调节以改善肝细胞损伤,促进β-EP释放及入血,抑制c-fos蛋白表达,以增强机体镇痛作用,同时增强对胃肠激素和内分泌的改善作用;酒炙后可以通过增加β-EP释放、抑制c-fos蛋白表达以及促进NO和PGI 2,扩张血管、抑制血小板活化、减少血小板聚集,改善PGI2/TXA 2、6-keto-PGF1α/TXB 2异常,以保持机体内环境的稳定,最终增强活血化瘀作用。佐证了郁金“醋炙后能引药入肝,增强疏肝止痛作用;酒炙后增强活血化瘀作用”炮制理论。4.气滞血瘀大鼠机体氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢、花生四烯酸代谢以及类固醇生物合成紊乱,黄丝郁金通过调节差异化合物尤其是对L-丙氨酸、乳酸、3-羟基丁酸、柠檬酸、花生四烯酸和胆固醇的调节,干预机体氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢、花生四烯酸代谢、类固醇生物合成等发挥治疗气滞血瘀的作用。醋炙后对L-丙氨酸、乳酸和胆固醇效果较好,酒炙后对乳酸、柠檬酸和花生四烯酸效果更优,基于代谢组学阐释郁金炮制机理。