狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性人兽共患病,一旦感染出现临床症状病死率为100%。犬冠状病毒病是由犬冠状病毒感染引起犬的一种接触性传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水和血便为主要特征,致死率较低,但与其他传染病如犬细小病毒、轮状病毒等混合感染时死亡率明显提高。本研究利用原核表达系统表达了犬冠状病毒N蛋白,免疫兔子后制备多克隆抗体,经过ELISA、Western blotting等试验鉴定,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体具有良好的反应特异性。本论文主要基于狂犬病病毒反向遗传操作系统研制狂犬病和犬冠状病毒病二联基因工程疫苗。以狂犬病病毒弱毒SAD毒株为骨架,分别在狂犬病毒的N、P基因之间插入犬冠状病毒N和S基因,构建狂犬病毒全长cDNA,然后与辅助质粒按一定的比例共转染BHK-21细胞拯救重组病毒,通过免疫荧光和qPCR试验筛选出含有目的基因的重组狂犬病病毒BNSP-CCV-N和BNSP-CCV-S,然后对重组病毒的生物学特性进行了鉴定,Western blotting试验和免疫荧光试验表明重组病毒BNSP-CCV-N可同时表达RV-G蛋白和CCV-N蛋白,重组病毒BNSP-CCV-S可同时表达RV-G蛋白和CCV-S蛋白。病毒生长曲线表明BNSP-CCV-N在72 h,BNSP-CCV-S在96 h后病毒滴度不再提高,由此可以确定重组病毒的最佳收毒时间。电镜观察表明插入外源基因的重组病毒可组装成有一定形态的完整病毒粒子。同时将重组病毒在BHK-21细胞中连续传10代,通过RT-PCR检测表明重组病毒携带外源基因具有遗传稳定性。进一步选用BALB/c小鼠模型对该重组病毒的致病性和疫苗的免疫效果进行评价,小鼠脑内注射两种重组病毒后观察14天,均未出现肉眼可见的临床症状,表明重组病毒对小鼠无致病性。将重组病毒进行浓缩、纯化,灭活后与GEL佐剂按一定的比例制备灭活疫苗和弱毒疫苗,分组免疫小鼠。试验结果表明制备的灭活疫苗和弱毒疫苗安全性良好,通过不同组别免疫小鼠抗体水平的比对,制备的重组病毒的弱毒疫苗产生较高的抗狂犬病毒的中和抗体,制备的灭活疫苗BNSP-CCV-N+S有较高的抗犬冠状病毒N蛋白和S蛋白的特异性抗体,结果表明重组病毒具有制备二联基因工程疫苗的潜力,在本动物的免疫保护试验有待于进一步研究。本研究利用反向遗传操作系统成功拯救出含有犬冠状病毒N和S基因的重组狂犬病毒,用其分别制备的灭活苗和弱毒苗免疫小鼠后诱导产生较高的抗狂犬病毒中和抗体和犬冠状病毒的特异性抗体,该研究为狂犬病和犬冠状病毒二联疫苗的研究提供了一定的参考价值。