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目的:1.探讨赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)缺失对T细胞及NK细胞谱系发育的影响。2.探索Vav-Cre介导的黄色荧光蛋白(YFP)报告基因系统标记小鼠体内自然杀伤(NK)细胞的特异性和效率。方法:本课题分两部分进行:第一部分:采用C57BL/6小鼠胸腺,制成单细胞悬液,通过流式细胞术分选、q RT-PCR方法检测LSD1在T细胞DP、SP发育阶段的表达情况;杂交含有LSD1(fl/fl)基因型和Lck-Cre+基因型小鼠,通过基因型分型筛选出LSD1(fl/fl)Lck-Cre+条件性基因敲除小鼠,采用杂交后代LSD1(wt/wt)Lck-Cre-小鼠(6周)作为对照组(WT),LSD1(fl/fl)Lck-Cre+条件性基因敲除小鼠(6周)作为实验组(KO),各取其胸腺、脾、淋巴结组织制成单细胞悬液,通过CD4、CD8、CD44和CD25细胞表面标记流式分析T细胞发育阶段各种细胞百分比的变化以及NKp46、NK1.1细胞表面标记流式分析NK细胞的百分比变化。第二部分:杂交ROSA26R-YFP和Vav-Cre+转基因鼠,通过基因型分型筛选ROSA26R-YFP与Vav-Cre+小鼠杂交后代中双阳性基因型小鼠,流式细胞术分析免疫器官淋巴结、脾、胸腺以及骨髓细胞的YFP表达效率,通过NK1.1和CD122细胞表面标记筛选出淋巴结、脾及骨髓的NK细胞,流式细胞术分析NK细胞群体中YFP阳性细胞百分比。结果:第一部分:(1)q RT-PCR检测LSD1在T细胞发育过程中DP、CD4(SP)、CD8(SP)细胞中的表达量,结果显示LSD1皆有显著表达,而DP、CD4(SP)、CD8(SP)细胞三者之间,DP细胞表达量最高,CD4和CD8细胞表达量无明显差异,LSD1在DP向SP的T细胞发育过程中表达量具有逐渐减低的趋势。(2)通过数次杂交LSD1(fl/fl)基因型和Lck-Cre+基因型小鼠,结果共获得3只LSD1(fl/fl) Lck-Cre+条件性基因敲除小鼠,它们分别来自不同的亲代。(3)细胞计数结果显示,LSD1基因敲除小鼠(KO)胸腺T细胞总数和对照组小鼠(WT)相比减少约10倍(KO 2.5±0.8×107 vs WT 23.0±7.2×107,P<0.05),淋巴结T细胞总数(KO11.0±2.5×107 vs WT13.0±3.7×107,P>0.05)和脾脏T细胞总数(KO 12.1±2.8×107 vs WT15.3±1.3×107,P>0.05)则没有显著差异。(4)流式细胞术分析胸腺T细胞中DP细胞(KO 63.5±12.4 vs WT 86.2±1.2,P>0.05)、CD4细胞(KO 15.3±4.8 vs WT7.9±0.8,P>0.05)、CD8细胞(KO10.7±6.1 vs WT 4.5±1.8,P>0.05)的百分比(%)变化没有显著差异,淋巴结T细胞中的CD8细胞百分比(%)(KO 13.4±1.0 vs WT28.3±0.6,P<0.05)和对照组相比减少了2.1倍,CD4细胞以及脾脏T细胞中的CD4、CD8均无显著差异(P>0.05)。(5)流式细胞术分析LSD1基因敲除小鼠(KO)胸腺T细胞中的DN1细胞的百分比(%)和对照组相比(KO 51.0±11.9vs WT16.7±1.3,P<0.05)增加了约3.1倍,而DN2、DN3、DN4均有不同程减少的趋势,但没有明显差异(P>0.05)。(6)流式细胞仪分析发现,和对照组小鼠(WT)相比,LSD1基因敲除小鼠(KO)胸腺NK细胞百分比(%)增加了约6倍(KO 4.2±1.2vs WT 0.6±0.3),淋巴结中NK细胞百分比(%)增加了约4倍(KO 8.9±1.0vs WT2.2±0.8),脾脏中NK细胞百分比(%)增加了约2.5倍(KO 22.0±2.2vs WT 8.7±1.3)(均P<0.05)。第二部分:ROSA26R-YFP与Vav-Cre小鼠杂交后代共17只,双阳性基因型小鼠(ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre)11只;流式细胞术分析淋巴结、脾、胸腺、骨髓细胞中YFP阳性细胞的百分比(%)分别为73.87±1.51、56.07±1.47、86.17±1.74、53.60±3.56,阴性对照组相应器官分别为0.27±0.01、1.33±0.91、0.11±0.01,0.29±0.03,差异有统计学意义(均P<0.01),两种类型小鼠非免疫器官肾中均无明显YFP表达(双阳性鼠0.72%±0.43%,对照鼠0.92%±0.27%,P>0.05);淋巴结、脾和骨髓中NK细胞YFP阳性百分比(%)76.94±0.84、81.66±1.18、88.92±0.77,与阴性对照组比较均明显增高(均P<0.01)。结论:本研究初步证明LSD1对T细胞及NK细胞谱系发育的影响,LSD1缺失后可以导致T细胞谱系形成障碍,同时促进NK细胞谱系的形成;利用Vav-Cre介导的YFP报告基因系统标记小鼠体内NK细胞具有特异性及高效性,T细胞向NK细胞转分化的功能分析有待进一步实验证明。