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目的:通过观察何首乌饮对大鼠睾丸间质细胞DNMTs活性的影响,探讨何首乌饮调控大鼠睾丸间质细胞衰老的甲基化机制。方法:1.差异贴壁法分离培养睾丸间质细胞,采用3β-HSD特异性染色,鉴定睾丸间质细胞纯度。2.采用氧化损伤方法建立细胞衰老模型,通过检测β-半乳糖苷酶表达水平,细胞周期和P16蛋白表达情况,判断衰老模型是否构建成功。3.采用构建的慢病毒转染睾丸间质细胞,将间质细胞中DNMT1基因敲低。4.通过MTT法检测细胞活力,荧光定量PCR检测DNMT1 mRNA的表达水平,筛选出DNA甲基转移酶抑制剂最适浓度和最佳作用时间。5.依据实验目的细胞分组为:正常组、衰老组、何首乌饮组、DNA甲基转移酶抑制剂组、DNA甲基转移酶抑制剂与何首乌饮共孵育组、DNMT1敲低组、DNMT1敲低与何首乌饮共孵育组、阴性质粒转染组。6.采用免疫荧光技术,检测P16蛋白的表达情况。7.采用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测各组表观遗传基因wnt2b和C-myb的启动子甲基化水平。结果:1.间质细胞衰老模型鉴定及细胞衰老对DNMT1表达影响:300μM H2O2与100μM FeSO4连续刺激四天后,β-半乳糖苷酶表达水平明显上升;细胞G1期比例增加,S期所占比重明显减少;P16蛋白表达明显增加,与正常组比较有统计学差异（P<0.05）。表明衰老模型建立成功。细胞衰老后,DNMT1 mRNA表达明显下降,与正常组相比较有统计学差异（P<0.05）。12.何首乌饮延缓间质细胞衰老作用:何首乌饮可以使衰老细胞β-半乳糖苷酶阳性率显著降低,并且使DNMT1 mRNA表达水平明显升高,细胞G1期比例减少,S期所占比重明显增加,P16蛋白表达明显降低,与衰老组比较有显著性差异（P<0.05）。3.DNMT1敲低诱导间质细胞衰老:将间质细胞DNMT1敲低后,发现β-半乳糖苷酶表达水平明显上升,细胞G1期比例增加,S期所占比重明显减少,P16蛋白表达明显增加,与正常组、阴性对照组比较有统计学差异（P<0.05）。表明DNMT1敲低可诱导间质细胞老化。4.何首乌饮对P16蛋白表达的影响:衰老组、DNMT1敲低组和DNA甲基化转移酶抑制剂（5-Aza）组P16蛋白表达高于正常组,具有统计学意义（P<0.05）,何首乌饮可以部分逆转这一现象（P<0.05）。5.何首乌饮对wnt2b和C-myb甲基化水平的影响:5.1 wnt2b:与正常组比较,衰老组、DNMT1敲低组甲基化水平明显升高,（P<0.05）。何首乌饮组和DNMT1敲低与何首乌饮共孵育组与衰老组比较甲基化水平降低（P>0.05）。DNMT1敲低与何首乌饮共孵育组和DNMT1敲低组相比甲基化水平明显降低（P<0.05）。甲基转移酶抑制剂组和正常组相比甲基化水平降低（P>0.05）。甲基转移酶抑制剂与何首乌饮共孵育组和甲基转移酶抑制剂组相比甲基化水平明显升高（P<0.05）。5.2 C-myb:与正常组比较,衰老组、甲基转移酶抑制剂组、DNMT1敲低组甲基化水平明显降低（P<0.05）。何首乌饮组、甲基转移酶抑制剂与何首乌饮共孵育组和DNMT1敲低与何首乌饮共孵育组与衰老组比较甲基化水平升高,其中甲基转移酶抑制剂与何首乌饮共孵育组与衰老组有统计学差异（P<0.05）,其余两组无统计学差异（P>0.05）。DNMT1敲低与何首乌饮共孵育组和DNMT1敲低组相比甲基化水平明显升高（P<0.05）。DNMT1敲低组和甲基转移酶抑制剂组相比甲基化水平明显降低（P<0.05）。结论:1.敲低DNMT1可以诱导睾丸间质细胞衰老。2.何首乌饮通过上调DNMT1活性抑制p16的表达。3.何首乌饮通过提高DNMTs活性,调控基因的甲基化水平,延缓睾丸间质细胞衰老。