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1背景及目的酗酒是严重的社会公害之一,过度饮酒造成的酒精中毒已成为独立的、不容忽视的致死因素。在法医学鉴定中,经常遇见饮酒后较轻微头颈部外伤引发的外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage, TSAH),其发生率约占TSAH的87%,死亡率达50%以上。由于目前对酒精和外力因素在TSAH发生及死亡机制中相互关系和作用程度大小尚无统一认识,致使此类案件的鉴定往往争议较大,亦给法庭审判量刑带来困难。因此,有必要深入研究酒后TSAH的发生及死亡机制,明确各因素在伤亡后果中的参与度,为此类案件法医学鉴定及审判量刑工作提供必要的科学证据和理论参考。本研究通过建立急慢性酒精中毒大鼠打击模型,检测不同时相点大鼠血乙醇浓度、凝血功能及抗凝活性变化系列指标,观察各指标变化的内在联系,从血液的酒精毒理学角度探讨急慢性酒精中毒大鼠TSAH发生机制。同时,检测血栓烷A-2及其受体表达并监测心功能变化,从脑-心联系角度探讨急慢性酒精中毒大鼠TSAH死亡机制。2材料与方法2.1动物分组与模型建立SPF级成年雄性SD大鼠90只,体重300±50g。实验动物分组见下表。实验大鼠灌胃和打击处置后观察0.5h,乙醚麻醉,腹主动脉采血并放血处死,立即开颅观察并记录TSAH发生率及出血量情况,留取脑、心、肝等组织冻存及固定处理。2.2实验方法观察实验大鼠的行为学、体重、血压、心电变化及脑组织病理学改变;气相色谱法检测血乙醇浓度(BAC);全自动凝血分析仪检测凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)及纤维蛋白原(FIB);全自动血气分析仪检测pH值、血氧饱和度(SaO2)、氧分压(PO2)、碳酸氢根(HCO3-)、剩余碱(BE)等7项血气分析指标;ELISA法检测血浆中组织因子(TF)、组织因子途径抑制剂(TFPI)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1)、D二聚体(D-D)及血栓烷B-2 (TXB-2)浓度;免疫组化法及免疫印迹法进行定性、定位及定量检测脑及心组织的tPA、TXA2R表达情况。统计TSAH发生率及死亡率,Fisher法分级TSAH。所有实验数据均采用SPSS 17.0及Excel 2007进行统计学处理和分析。3结果3.1行为学表现及体重、血压变化急性灌酒组大鼠酒后0.5h内兴奋性增强,此后逐渐出现昏睡、翻正反射消失等急性酒精中毒表现,4-6h后逐渐清醒。慢性灌酒组大鼠每次灌酒后均有急性酒精中毒表现,灌酒1周后体重明显下降,至第4周末下降达60g以上(p<0.01)。第3周始尾动脉压自16.60±0.76 kPa升高至17.48±0.90 kPa (p<0.05)。打击后,实验组大鼠均呈典型的脑震荡表现,AA/AW/CW及部分CA组大鼠3-5sec后渐至正常,55%(11/20) CA组大鼠出现角膜反射消失、四肢抽搐、口唇发绀、呼吸由深大转至浅慢,2-4min内迅速死亡。3.2心电变化脑震荡性打击后,各实验组均出现一过性心电基线漂移,心率从正常的400 bpm增至500-600 bpm,约5-6sec后渐至正常,而慢性灌酒组死亡大鼠在心电恢复正常后30-60sec内,心率骤减至100-200 bpm伴心律不齐,而后逐渐减慢,直至消失,心电呈直线改变,此过程历时约2-4min。3.3脑组织病理学观察和TSAH发生率及死亡率急性灌酒组伤后脑组织轻度淤血、肿胀,多数有少量蛛网膜下腔出血,局限于脑干腹侧面或小脑表面,脑神经元及胶质细胞轻度水变性。慢性灌酒组伤后脑组织中至重度淤血、肿胀,多数有较多量蛛网膜下腔出血,广泛分布于全脑,脑神经元及胶质细胞水变性,可见噬神经和卫星现象;小脑蒲肯野细胞排列疏密不均,部分溶解消失;脑干神经核团多见“暗神经元”,呈深暗红色、胞体皱缩、胞浆及胞核浓缩、均质化、核不清或消失、轴突不规则扭曲等表现。急慢性组脑实质内均未见明显挫伤及出血改变。急慢性灌酒组TSAH发生率分别为26%及85% (p<0.01),死亡率分别为0及55% (p<0.01),且死亡大鼠均发生TSAH。3.4血乙醇浓度变化灌酒后2h大鼠BAC达峰值188.16±14.71 mg/dL,0.5h至4h始终处于人醉酒下限值80 mg/dL之上,6h后仍达60.08±13.80 mg/dL。3.5凝血功能变化及与BAC、TSAH的相关性分析急性灌酒组各时相点血浆中PT、TT、APTT均不同程度延长,2h最明显,分别达28.50±2.08、35.49±1.15、24.56±1.09 sec (p<0.01);FIB先升高(0.5h,p<0.05)后下降(1h,p<0.05)再缓慢回升趋于正常。慢性灌酒组各指标亦不同程度延长和增高,与相应对照组(Control/CW)比较差异显著(p<0.05),但与AA-2h组比较差异不明显(p>0.05)。急性灌酒组PT、TT及APTT与BAC存在较强的相关性(分别r=0.789,0.818,0.752),呈正相关线性分布;FIB与BAC二者相关性不明显(p>0.05)。急性灌酒组各时相点TSAH发生率与对应的BAC存在高度正相关(r=0.974),决定系数R2=0.949。3.6血气分析变化急性灌酒组动脉血pH值、SaO2、PO2、HCO3-、BE均不同程度降低,2h达最低点(分别为7.26±0.05、97.77±0.36、12.70±3.67、14.17±0.95、-12.57±2.90) (p<0.05),此后缓慢回升,部分指标至6h仍未恢复正常范围。慢性灌酒组亦有不同程度降低,与相应对照组比较均有显著差异(p<0.05),急慢性灌酒组间差异不显著(p>0.05)。3.7血浆TF/TFPI、tPA/PAI-1、D-D及TXB-2浓度变化急性灌酒组各时相点TF不同程度降低,2h达最低点385.32±104.13 pg/ml (p<0.01),TFPI不同程度升高,2h达峰值1611.65±211.59 pg/ml (p<0.01);TF/TFPI先降后升,2h达最小值0.2391。慢性灌酒组二者与相应对照组及AA-2h组比较差异显著(p<0.05)。急性灌酒组各时相点tPA及PAI-1均不同程度升高,2h分别达峰值6422.18±119.76 pg/ml (p<0.01)及21246.67±1346.07 pg/ml (p<0.01),tPA/PAI-1先升后降,2h达最大0.3023。慢性灌酒组tPA及PAI-1与相应对照组及AA-2h组比较差异亦显著(p<0.05)。急性灌酒组各时相点D-D不同程度升高,0.5h-6h与相应对照组比较差异显著(p<0.05),2h达峰值2207.40±322.12 pg/ml (p<0.01)。慢性灌酒组D-D与相应对照组及AA-2h组比较有显著差异(p<0.05)。急性灌酒组各时相点TXB-2略升高,1h与相应对照组差异显著(p<0.05)。慢性灌酒组TXB-2明显升高,与相应对照组及急性灌酒组比较均有高度显著差异(p<0.01)。3.8脑及心组织tPA/TXA2R表达变化目的蛋白tPA在各组额叶、小脑、脑干延髓腹侧及背侧面的免疫印迹膜67kDa处均出现清晰条带。三个对照组条带较窄细、色淡,急慢性灌酒组条带较粗深。IHC光密度分析结果显示,急性灌酒组tPA表达均明显增加,与相应对照组差异高度显著(p<0.01),2h表达最强,IOD值分别为65975.29±5961.34、70203.96±5406.58、64696.20±6394.44及68072.76±4471.79。慢性灌酒组tPA表达亦增强,与相应对照组差异亦高度显著(p<0.01),与AA-2h组比较,除额叶外,其余部位tPA表达量均有显著差异(p<0.05)。目的蛋白TXA2R在脑干及心组织的免疫印迹膜58kDa处均出现较清晰条带,但是脑(除慢性灌酒组)及心的各实验组条带均较窄细,其中慢性灌酒组条带粗深,其IOD值达6188.04±391.11,与相应对照组、急性灌酒组以及同组的心脏差异均高度显著(p<0.01)。4结论(1) BAC与凝血功能、TSAH三者间存在明显的剂量-效应关系:BAC越高,凝血时间越长,TSAH发生率就越高;酗酒时间越长,凝血功能破坏越严重,TSAH发生率及死亡率就越高。(2)急慢性酒精中毒均可抑制TF/TFPI的凝血启动机制、增强tPA/PAI-1的纤溶激活作用,破坏二者动态平衡,降低凝血功能,长期酗酒更显著,成为酒后TSAH高发生率的重要机制之一。(3)急慢性酒精中毒导致的机体持续低氧状态,可促进血管内皮tPA过度表达、纤溶活性增强,构成酒精抑制凝血功能的重要机制之一。(4)本研究首次从脑-心联系角度,探讨酒后TSAH死亡可能机制。认为:长期酗酒血液TXA-2含量增高、脑组织TXA2R表达增强,二者在TSAH脑组织中快速大量结合,通过5-羟色胺能信号通路,过度抑制低位脑干中线区的生命中枢,过度兴奋迷走神经以抑制心脏活动,可能是慢性酒精中毒TSAH高死亡率的重要机制之一。