NKX3.1是前列腺细胞特异表达的、受雄激素调节的同源盒基因,在前列腺胚胎发育、上皮分化及肿瘤发生发展中起重要作用。在胚胎形成过程中,NKX3.1的表达可作为前列腺上皮分化的重要标志。NKX3.1基因敲除的老鼠显示前列腺上皮发育不良、腺管形态异常和蛋白分泌障碍,表明NKX3.1对于前列腺的正常发育及维持前列腺上皮的正常分化是必需的。更重要的是NKX3.1基因敲除鼠随着年龄的增长,出现了类似于人前列腺上皮内瘤(intraepithelialneoplasia,PIN)的病理变化,表明NKX3.1缺失可能与前列腺癌的起始有关。人同源盒基因NKX3.1位于染色体8p21,基因全长约4.2 kb,编码234个氨基酸,其产物在结构与功能上属于核转录因子。研究发现,约90%的前列腺肿瘤中存在染色体8p21区域的杂合缺失,NKX3.1即定位于此区域,认为NKX3.1在前列腺癌中可能作为抑癌基因发挥作用,它的表达缺失不仅与前列腺癌的起始及其进展有密切关系,而且决定了肿瘤发生的组织特异性。胚胎的发生与肿瘤的发生被认为是两个密切相关的过程。人同源盒基因NKX3.1是目前唯一已知参与前列腺的胚胎发育和前列腺癌发生两个过程的基因,因而NKX3.1基因的研究为进一步探讨前列腺的胚胎发育和肿瘤发生两个过程之间的关系以及同源盒基因在这两个过程的作用提供了一个理想的模式。但是,目前,关于人同源盒基因NKX3.1在前列腺癌发生发展中的作用及其作用机理尚不完全清楚。NKX3.1作为体内重要的转录因子,受其调控的靶基因目前知道的很少,本研究从筛选鉴定NKX3.1调控的下游靶基因入手,探讨NKX3.1在前列腺癌细胞中的作用及机理。首先通过稳定转染NKX3.1表达载体,使NKX3.1在前列腺癌细胞PC-3中恢复表达,然后应用基因芯片检测NKX3.1诱导的PC-3细胞基因表达谱的改变,分析筛选差异表达基因,并分别在NKX3.1表达载体稳定转染的PC-3细胞系和NKX3.1干扰RNA表达载体稳定转染的LNCaP细胞系验证相关基因的表达;最后,根据基因芯片结果,我们进一步探讨了NKX3.1对其下游靶基因胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)和caspase3基因的调控机制及其功能影响。本研究为进一步阐明NKX3.1在前列腺发育及肿瘤发生发展中的作用及其基因表达调控机制奠定了基础,有助于我们深入了解前列腺癌发生发展的分子机理并为前列腺癌的临床诊断和治疗提供新的思路和靶点。第一部分构建NKX3.1稳定表达的PC-3细胞系及基因芯片检测NKX3.1诱导的基因表达谱的改变【研究目的】应用基因芯片检测NKX3.1诱导的PC-3细胞基因表达谱的改变,筛选鉴定NKX3.1调控的下游靶基因,为进一步明确NKX3.1在前列腺癌发生发展中的作用奠定基础。【研究方法和结果】1.本实验室前期工作已经构建NKX3.1-cDNA真核表达载体peDNA3.1-NKX3.1,应用脂质体将其转染至前列腺癌细胞PC-3,通过G418筛选、有限稀释法克隆培养获得NKX3.1稳定转染的PC-3(+)细胞,转染空载体pcDNA3.1组作为对照;RT-PCR,Western blotting验证NKX3.1在PC-3(+)细胞中的表达;结果显示:在筛选的9个细胞克隆中,NKX3.1在1,2,3,4,5,8,9细胞克隆中均稳定表达,尤以克隆8中的表达更为明显。2.MTT法、细胞克隆形成实验及Trans-well细胞侵袭实验检测NKX3.1对细胞克隆1,8和9细胞增殖、侵袭能力的影响;结果显示:PC-3(+)细胞克隆1,8和9细胞生长受到显著抑制,生长抑制率大约为50%;细胞克隆形成能力较空白对照组减弱大约21.5%;clonel,8和9侵袭至Matrilgel滤膜下的细胞数分别为(63±11),(55±17)和(51±12),明显少于空白对照组(144±13)。3.分别提取稳定转染pcDNA3.1-NKX3.1和pcDNA3.1空载体的PC-3细胞总RNA,利用含有22,000个人类基因的基因芯片检测NKX3.1恢复表达后引起的PC-3细胞基因表达谱的改变。结果显示:在检测的22,000个基因中有1,953个基因的表达发生了2倍以上的变化,其中1013个基因表达上调,940个基因表达下调。139个基因的表达发生了10倍以上的变化,其中128个基因表达下调,11个基因表达上调。这些发生变化基因的功能涉及多个方面,包括细胞生长增殖、细胞凋亡、信号转导、细胞黏附与侵袭等。4.构建NKX3.1 siRNA真核表达载体pRNAT-RNAi,应用脂质体将其转染至LNCaP细胞。G418筛选、有限稀释法克隆培养获得稳定转染pRNAT-RNAi的LNCaP细胞株LNCaP(-),并应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定证实NKX3.1在LNCaP(-)细胞中表达降低。随机选择基因芯片中差异表达的基因bcl-2,sp1,sod2,cyclinE,P27,Tusc3,Cdk6和AMACR,应用RT-PCR,Western在上述PC-3(+)/PC-3和LNCaP/LNCaP(-)细胞中进行验证。结果显示:4组细胞的RT-PCR和Western blotting结果与芯片结果一致。【结论】1.NKX3.1在PC-3(+)细胞中稳定表达,并且能够引起PC-3细胞表型的改变,如:增殖速度减慢,侵袭力下降。2.NKX3.1恢复表达可引起前列腺癌细胞PC-3基因表达谱的广泛变化,提示NKX3.1在前列腺癌细胞中可能通过与这些基因的相互作用而发挥非常多样广泛的作用。为进一步深入研究NKX3.1基因与前列腺癌发生、发展的关系提供了理论依据。第二部分NKX3.1上调caspase3基因表达,促进细胞凋亡的作用研究【目的】研究NKX3.1对caspase3的正向调控作用并初步探讨其机制。【研究方法和结果】1.基因芯片结果显示,NKX3.1稳定表达的PC-3(+)细胞中,caspase3表达升高,进一步应用RT-PCR、Western blotting进行验证;结果显示PC-3(+)细胞中caslaase3 mRNA和蛋白质的表达均高于PC-3细胞。2.应用凋亡诱导剂肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和放线菌酮(Cycloheximide,CHX)同时作用PC-3和PC-3(+)细胞,caspas3活性检测试剂盒检测两组细胞中caspase3的活性,流式细胞术检测细胞凋亡率;结果显示:10 ng/mlTNF-α和10μg/ml CHX作用6 h,PC-3细胞中caspase3活性升高1.4倍,而PC-3(+)细胞中caspase3活性升高2.4倍;流式细胞仪检测细胞凋亡率显示,PC-3细胞凋亡率3.14%,而PC-3(+)细胞凋亡率为8.2%。3.提取人基因组DNA,PCR扩增caspaSe3基因5’上游3764 bp(-2880 bp/+884bp)启动调控区序列,插入pGL3-basic,构建caspase3启动子-荧光素酶报道基因表达载体pGL3-pcas,进行酶切和测序鉴定;结果显示:重组质粒pGL3-pcas酶切鉴定及DNA测序结果均正确。4.pGL3-pcas瞬时转染前列腺癌细胞PC-3,同时与pcDNA3.1或pcDNA3.1-NKX3.1共转染PC-3细胞,荧光素酶报道基因分析检测caspase3启动子活性及NKX3.1对启动子活性的影响;结果显示:caspase3基因上游3764 bp片段具有明显的启动子活性,转染NKX3.1可使该启动子活性升高3倍。5.计算机软件MatInspector2.2分析caspase3基因3.7 kb启动子区存在3个NKX3.1可能的结合序列(NBS1～3)。首先通过电泳迁移率变动实验(EMSA)、染色质免疫共沉淀(ChIP)检测NKX3.1与NBS1～3的结合活性。然后,人工合成NBS1～3,将其插入pGL3-promoter的SV40启动子上游,与pcDNA3.1/pcDNA3.1-NKX3.1共转染PC-3细胞,报道基因分析启动子活性变化,确定NBS1～3的功能。结果显示:EMSA和ChIP检测表明NKX3.1与NBS3序列有特异的结合活性。进一步的报告基因检测显示NBS3可以使SV40启动子活性增加1.86倍,而NBS1和NBS2则在共转染后对SV40启动子活性没有明显的影响。【结论】1.NKX3.1能够在转录水平上调PC-3细胞中caspause3的表达,从而促进caspase3的活化,促进TNF-α和CHX对细胞凋亡的诱导作用。2.NKX3.1可以通过与caspase3基因上游一个功能性的NKX3.1结合元件NBS3(-718 bp/-732 bp)的结合正向调控caspase3基因的表达,从而促进对细胞凋亡的诱导作用。第三部分NKX3.1下调胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)基因表达,抑制细胞增殖的作用研究【研究目的】研究NKX3.1对IGF1R的负向调控作用并初步探讨其机制。【研究方法和结果】1.基因芯片结果显示,NKX3.1稳定表达的PC-3(+)细胞中,IGF1R表达降低,进一步应用RT-PCR、Western blotting进行验证;结果显示PC-3(+)细胞中IGF1R mRNA和蛋白质的表达均低于PC-3细胞。2.100ng/ml IGF1分别作用PC-3和PC-3(+)细胞,MTT法、流式细胞术检测IGF1对两组细胞细胞增殖和细胞周期的影响;结果表明:100ng/ml IGF1作用24 h,PC-3细胞增殖增殖活性增加55.1%,G0/G1期细胞由68.18%减至56.85%;而PC-3(+)细胞增殖活性增加17.1%,G0/G1期细胞期细胞由92.4%减至85.51%。3.提取人基因组DNA,PCR扩增IGF1R基因5’上游3304 bp(-3259 bp/+45 bp)启动调控区序列,插入pGL3-basic,构建IGF1R启动子-荧光素酶报道基因表达载体pGL3-pIGF1R,进行酶切和测序鉴定;结果显示:重组质粒pGL3-pIGF1R酶切鉴定及DNA测序结果均正确。4.pGL3-pIGF1R瞬时转染前列腺癌细胞PC-3,同时与pcDNA3.1或pcDNA3.1-NKX3.1共转染PC-3细胞,荧光素酶报道基因分析检测IGF1R启动子活性及NKX3.1对启动子活性的影响;结果显示:该3304 bp片段具有启动子活性,转染NKX3.1可使该启动子活性降低50%。5.计算机软件MatInspector2.2分析IGF1R基因3304 bp启动子区存在2个NKX3.1可能的结合序列(NBS1～2)。首先通过EMSA、ChIP检测NKX3.1与NBS1～2的结合活性。然后,人工合成NBS1-2,将其插入pGL3-promoter的SV40启动子上游,与pcDNA3.1/pcDNA3.1-NKX3.1共转染PC-3细胞,报道基因分析观察启动子活性变化,确定NBS1～2的功能;结果显示:EMSA和ChIP检测表明NKX3.1与NBS1～2均无明显的结合活性。进一步的报告基因检测显示NBS1～2对SV40启动子活性没有明显影响。【结论】1.NKX3.1能够在转录水平降低PC-3细胞中IGF1R的表达,并且抑制IGF1对细胞增殖的激活作用。2.NKX3.1不是通过与NKX3.1的结合序列直接结合发挥其对IGF1R基因的调控作用,可能通过与其他反式作用因子间接作用负向调控IGF1R基因的表达,从而抑制IGF1/IGF1R对细胞增殖的调节作用。NKX3.1调控IGF1R基因表达的机制有待于进一步研究。