第一部分骨髓间充质干细胞的体外培养、纯化及鉴定目的建立一种体外培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的简便有效方法,为后续的实验提供细胞来源。方法1.取2周纯系清洁级雄性SD大鼠,全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过体外培养及连续传代方法纯化、扩增骨髓间充质干细胞。2.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,利用流式细胞仪(FCM)鉴定骨髓间充质干细胞表面膜抗原。3.对分离培养的细胞行成骨、成软骨、成脂肪诱导分化,进一步确定骨髓间充质干细胞的分化潜能。结果1.取材6h后可见细胞贴壁,散在分布,3d后贴壁细胞牢固粘附,细胞体积增大,颗粒增多,呈现集落生长,7d后细胞胞体狭长,漩涡状或纺锤状排列,传代后,细胞形态均一；2.流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞膜表面抗原CD90、CD105、CD73、D34、CD45、CD14阳性率分别为99.4%、99.7%、99.6%、2.0%、2.5%、3.5%；3.成骨诱导分化后行茜素红染色呈现大量橘红色的钙结节,成脂肪诱导分化后行油红O染色可见胞浆内大量鲜红的脂滴,折光性极强,成软骨诱导分化后形成质地致密的细胞团,阿利新蓝染色可见细胞内大量蓝色基质颗粒。结论全骨髓贴壁法并连续传代法能得到纯化的骨髓间充质干细胞,是一种简便而又有效的分选培养方法。用此方法培养的骨髓间充质干细胞生长状态良好、性状稳定、分化潜能强大,是一种理想的组织工程种子细胞,并为后续的实验提供了稳定的细胞来源。第二部分Wnt通路和Sox9互反馈调节在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用目的通过观察Wnt通路与Sox9在MSCs成软骨诱导分化过程的表达及关联,并重点研究Wnt通路调控Sox9表达调节MSCs成软骨分化的作用及机制,以及Sox9过表达反馈调节Wnt通路的活性影响MSCs成软骨分化的作用。从而为更精细控制MSCs分化,促进创伤愈合,丰富再生医学提供理论依据。方法1.体外培养骨髓间充质干细胞,LiCl刺激干预骨髓间充质干细胞,CCK-8法观察骨髓间充质干细胞增殖活性以及Western blot检测PCNA的表达情况。2.在骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化中,Western blot、RT-qPC检测各时期软骨指标Sox9、Collagen2a、Aggrecan及Wnt通路关键分子β-catenin的表达情况,并LiCl及Dkk-1分别刺激干预骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化,重点检测早期(第7d)及晚期(第21d)Wnt通路的蛋白表达及软骨相关指标的mRNA及蛋白的表达情况。3.在骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化后期(21d-35d), RT-qPCR检测成熟软骨Collagen2a及肥大指标Collagen10、早期成骨分化指标RUNX2mRNA水平,Western blot检测β-catenin及Sox9蛋白的表达。通过LiCl及Dkk-1刺激干预,在骨髓间充质干细胞成软骨分化后期(28d),Western检测Collagen2a、Collagen10、RUNX2蛋白等分化指标以及Sox9及β-catenin蛋白水平。4.Sox9慢病毒载体阳性转染骨髓间充质干细胞,RT-qPCR检测成软骨诱导分化过程中Collagen2a、Aggrecan表达水平,定量测定分泌型GAG含量,同时Western blot检测Sox9及β-catenin蛋白水平；在成软骨诱导分化第21天,免疫荧光检测Collagen2a表达情况,Western blot检测Wnt通路相关蛋白GSK-3β、β-catenin、 p-β-catenin蛋白的表达。结果1.LiCl刺激组的骨髓间充质干细胞增殖能力增强,且高表达PCNA蛋白。2.在成软骨诱导分化中,Sox9、Collagen2a、Aggrecan的mRNA及蛋白表达随着时间延长逐渐增高,分泌型GAG含量随着时间逐渐增高,且在第14d增加显著,而P-catenin蛋白出现先减少后增加的表达趋势。在成软骨诱导分化早期(第7d), LiCl促进β-catenin蛋白表达,同时促进增殖相关蛋白PCNA及Cyclin D蛋白的表达,而Dkk-1抑制β-catenin蛋白表达并减少PCNA及Cyclin D蛋白的表达；在LiCl组Sox9、Collagen2a、Aggrecan蛋白软骨相关指标表达,Dkk-1组有相反的结果。在成软骨诱导分化晚期(第21d),LiCl组P-catenin蛋白表达增高而Dkk-1组表达受抑制,同时LiCl组阿利新蓝染色明显增强而Dkk-1组染色减弱；分泌型的GAG含量测定有相似的结果；软骨指标Sox9、Collagen2a、 Aggrecan mRNA及蛋白测定显示LiCl组表达明显增高,而Dkk-1组明显减低。3.在成软骨诱导分化后期(21d-35d),随着时间的延长,Collagen2a表达逐渐减少,Collagen10及RUNX2mRNA表达逐渐增高,而β-catenin蛋白表达逐渐增多,与Sox9蛋白表达恰恰相反。在LiCl及Dkk-1干预下,我们发现LiCl在促进β-catenin蛋白表达增多的同时,明显促使Sox9及Collagen2a蛋白表达下调,并上调Collagen10a及RUNX2蛋白的表达。4.在对骨髓间充质干细胞成功转染Sox9慢病毒后,我们设置了Sox9慢病毒转染组。在成软骨诱导分化中,转染组明显高表达Collagen2a及Aggrecan mRNA,分泌型GAG含量测定也显示转染组显著高于对照组,同时在Western blot检测中,转染组β-catenin蛋白表达显著低于对照组。在成软骨诱导分化第21天,免疫荧光显示转染组明显高表达Collagen2a,此时的Western blot检测显示GSK-3p蛋白及β-catenin磷酸化水平增高。结论1.LiCl能激活Wnt通路促进骨髓间充质干细胞快速增殖。2.LiCl激活Wnt通路关键蛋白β-catenin,在成软骨诱导分化中,早期主要促进骨髓间充质干细胞快速增殖,同时调控Sox9促进成软骨诱导分化；晚期则继续调控Sox9促进成软骨诱导分化为主；后期逐渐下调Sox9,减弱成熟软骨表型表达,促进软骨肥大及早期成骨。而Dkk-1抑制Wnt通路,起到相反的作用。3.Sox9过表达反馈抑制β-catenin的表达,并促进β-catenin蛋白降解,最终维持成软骨诱导分化。第三部分Wnt通路与NF-κB通路共调节在炎性环境下骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用目的探讨Wnt通路调控对炎症环境骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响,分析Wnt通路和NF--κB通路的相互作用关系,为促进干细胞炎症环境成软骨分化和临床治疗关节软骨损伤提供一种可行方案。方法1.体外培养骨髓间充质干细胞,IL-1刺激创造炎性微环境,并行成软骨诱导分化,阿利新蓝染色检测软骨基质内硫酸软骨素的表达,定量检测分泌型GAG含量。2.在IL-1刺激的炎性微环境下行成软骨诱导分化,同时分别予以Wnt激动剂LiCl及抑制剂GSK-3β刺激干预,第21d时免疫荧光检测Collagen2a表达情况,分泌型GAG含量定量检测,RT-qPCR检测成软骨指标Sox9、Collagen2a、 Aggrecan mRNA的表达；与此同时,Western blot检测NF--κB通路相关蛋白Ikkβ蛋白、IKB蛋白、NF-κB蛋白及其相应磷酸化水平,以及NF-κB蛋白核内表达情况；Western blot检测Wnt通路相关蛋白P-catenin蛋白、GSK-3p蛋白及其相应磷酸化水平,以及β-catenin蛋白核内表达情况结果IL-1组阿利新蓝染色明显减弱,分泌型GAG含量显著降低,且软骨指标Sox9、Collagen2a、Aggrecan mRNA较空白对照组显著减低。在IL-1刺激的炎性微环境下成软骨诱导分化中,免疫荧光显示LiCl组Collagen2a表达明显增多,分泌型GAG含量也明显增多,同时RT-qPCR显示LiCl组软骨指标Sox9、Collagen2a、Aggrecan mRNA也明显表达增多,而GSK-3p组则表现相反的结果。与此同时,Western blot发现LiCl组的NF--κB通路相关蛋白IKB蛋白、NF-κB蛋白显著增多,相应蛋白磷酸化水平明显减低,但GSK-3β组相应蛋白磷酸化水平显著增高,核蛋白分析发现LiCl组的NF-κB核内表达明显减弱而GSK-3β组显著增多；另外,Western blot检测Wnt通路相关蛋白发现LiCl能显著抑制GSK-3β磷酸化,从而抑制β-catenin蛋白磷酸化,增加其表达,并促进去核内聚集,而GSK-3β组恰有相反结果。结论IL-1刺激的炎性微环境不利骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化。Wnt通路激动剂LiCl能显著抑制GSK磷酸化,从而抑制β-catenin蛋白磷酸化,增加其表达,并促进去核内聚集,同时竞争抑制NF-κB核内受体,反馈调节NF-κB通路,从而促进炎性环境下骨髓间充质成软骨诱导分化的进行。