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目的:1.建立纳米磁珠提取血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV DNA)联合量子点标记荧光探针检测HBV变异位点(M204I位点突变)的新方法。2.探讨新方法检测M204I位点突变在评价慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)核苷(酸)类(nucleos(t)ide analogues,NAs)药物治疗应答不佳患者中的意义。方法:将罗氏COBAS Taq Man检测的病毒载量为107IU/m L的血清样本,倍比稀释成不同浓度的HBV DNA作为血清标准品(理论值),分别用本方法(试剂1)、磁珠法(试剂2)、煮沸法(试剂3)三种方法提取HBV DNA,从检测结果与理论值的相关性以及可重复性方面比较本实验的纳米磁珠提取方法与国产磁珠法核酸自动提取法和传统煮沸法的提取效果。收集临床符合耐药,且直接测序法检测到有M204I位点突变的血清样本8例,不含有M204I位点突变的血清样本15例,设计并确定含有M204I位点突变的引物及探针序列,用量子点标记荧光探针杂交法检测HBV M204I变异位点,与直接测序法的检测结果进行比较,评价新方法检测位点变异的诊断效能,以及此方法在检测核苷(酸)类药物治疗应答不佳的慢乙肝患者HBV M204I位点变异时的意义。结果:纳米磁珠提取HBV DNA方法与理论值的相关性:试剂1、试剂2、试剂3提取HBV DNA定量与理论值相关性分析的r值分别为0.986(P<0.001)、0.950(p=0.001)、0.979(P<0.001),差异均具有统计学意义。三种方法检测的相对偏差均值分别为0.243±0.405(试剂1)、1.189±0.855(试剂2)、-0.439±0.618(试剂3)。在检测低水平HBV DNA定量时,理论值为101IU/ml,试剂1为3.520×101IU/ml,试剂2为9.123×103IU/ml,试剂3为6.195×101IU/ml。可重复性:试剂1对同一样本在不同时间检测结果的相对偏差均值为0.505±0.659。量子点标记荧光探针检测HBV M204I变异位点的检测下限是103IU/ml,且病毒水平越高,荧光光点越密集。利用量子点标记荧光探针法对临床中出现对核苷(酸)类药物治疗应答不佳的28例慢乙肝患者的HBV M204I位点进行检测,并与直接测序法比较,其中11例测序阳性样本中均检测到M204I位点的突变,17例测序阴性样本中均未检测到M204I位点的突变,两种方法检测结果一致。结论:利用纳米磁珠提取HBV DNA联合量子点探针杂交法检测病毒HBV DNA聚合酶基因变异的方法灵敏、准确,简便易行,为检测乙型肝炎病毒M204I位点变异提供了一个新的手段,且HBV DNA聚合酶位点变异可能是导致慢乙肝患者抗病毒治疗过程中发生应答不佳的原因之一。