目的1.探讨人泪腺腺样囊性癌细胞系的生物学特性。2.建立人泪腺腺样囊性癌的动物模型,为研究泪腺腺样囊性癌的发生发展以及治疗提供实验依据和条件。3.从人泪腺腺样囊性癌细胞系LACC中分离培养泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞,并对其特性进行鉴定。方法1.实验第一部分：将人泪腺腺样囊性癌(lacrimal adenoid cystic carcinoma,LACC)细胞系接种于10只裸鼠腋下的皮下,注射细胞悬液后每天观察裸鼠并测量裸鼠荷瘤的最长径L和最短径W,并用公式V(荷瘤体积)=(L×W2)/2计算出荷瘤的体积。分别于注射细胞悬液后14天、28天、35天、42天、49天随机取2只裸鼠的荷瘤以及裸鼠的肝脏、肺和腋下淋巴结。对注射细胞后14天的荷瘤行透射电镜观察,对注射细胞后14天、28天、35天、42天、49天的荷瘤行HE染色、免疫组织化学染色检测Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100、Desmin的表达以及提取其总RNA,用RT-PCR检测该荷瘤的人类β-actin的表达情况。对所取的裸鼠肝脏、肺和腋下淋巴结组织切片,行HE染色,观察有无肿瘤转移。2.实验第二部分：将LACC细胞消化、离心制成单细胞悬液,悬浮于无血清培养基(serum free medium,SFM)中获得肿瘤细胞微球体；应用有限稀释和单克隆形成实验确定该细胞系中肿瘤干细胞的比例；MTT检测肿瘤微球体的增殖能力以及其耐药性；流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD44+/CD24-在两种细胞中的表达情况；向SFM中滴加含有血清培养基(serum supplied medium,SSM)诱导LACC肿瘤微球体分化,并观察其形态学变化。结果1.接种细胞系后7天10只裸鼠腋下皮下全部长出荷瘤,成瘤率为100%。注射细胞悬液后14天取出的荷瘤呈圆形或椭圆形,表面可见包膜；不与周围组织粘连；荷瘤质地中等,剖面呈苍白色。注射细胞悬液后49天的荷瘤表面仍可见包膜,荷瘤侵入裸鼠胸壁,甚至侵入胸腔生长,但不与胸腔脏器粘连。2.荷瘤的组织形态学及生物学行为观察：1)HE染色观察见荷瘤具有典型的上皮性肿瘤组织结构。荷瘤以实体形为主,局部见粘液变、筛网样结构；细胞为圆形或椭圆形,细胞边界不太清楚,有丰富的粉染的胞浆,细胞核深染、大小差异明显,可见瘤巨细胞,病理性核分裂常见。2)透射电子显微镜下观察示荷瘤瘤细胞大小不等。相邻细胞间以缝隙连接为主,偶见发育不良的桥粒,细胞表面有微绒毛,未见明确腺管形成。胞浆内粗面内质网轻度扩张,散在线粒体,可见多聚核糖核蛋白体。有些肿瘤细胞胞浆中可见束状微丝。核浆比例倒置,核形态不规则,核膜凹陷,可见多核仁,核周间隙扩大。未见到典型核分裂相。3)免疫组织化学染色示荷瘤对Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100阳性表达,Desmin阴性表达。4)RT-PCR检测荷瘤表达人类β-actin基因。5)光镜下观察,未发现肿瘤转移至裸鼠肝脏、肺和腋下淋巴结。3. LACC细胞系中有(0.92±0.015)%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活增殖形成自由漂浮的细胞微球体；微球体形状规则,立体感强,球体内细胞排列紧密,富有折光性,并可稳定传代。与贴壁细胞相比,LACC肿瘤微球体具有更强的体外增殖能力、对顺铂具有更强的耐药性。流式细胞仪表面标志检测,LACC细胞CD44+/CD24比率为23.77%,而LACC肿瘤微球体CD44+/CD24比率为84.25%。在含血清环境下LACC肿瘤细胞微球体可分化为贴壁生长的单层细胞,与SSM中培养的LACC细胞无明显差异。结论1.人泪腺腺样囊性癌细胞系(LACC)具有一般恶性肿瘤的特点,同时也具有腺样囊性癌细胞的特点。荷瘤具有与原瘤一致的组织学特性,该动物模型易复制,时间短,成功率高,是研究泪腺腺样囊性癌的良好模型,为研究该肿瘤的发生发展以及治疗途径提供了一个极为有用的工具。2.用含有生长因子的SFM悬浮人泪腺腺样囊性癌细胞系LACC可获得泪腺腺样囊性癌肿瘤细胞微球体,此肿瘤微球体中富集有肿瘤干细胞,这为人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞的研究提供了一个理想的模型系统。