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纤维蛋白是血液凝固的重要成分之一,它是在循环系统中由纤维蛋白原经凝血酶作用转变而成的,发挥着凝血和生理止血的功能。纤维蛋白还参与体内的炎症、组织损伤、组织修复等一系列病理和生理过程。因此,对纤维蛋白的结构和功能的深入研究不仅有助于我们认识纤维蛋白在凝血过程中的重要地位,也为我们在科研和临床治疗方面提供了新的思路。 近年来,随着纳米科技的发展,纳米材料已广泛应用于生物传感技术。本论文利用纳米金和单壁碳纳米管的纳米特性,建立非标记检测纤维蛋白的方法。具体内容如下: 一、基于纳米金内滤效应,非标记、高灵敏检测纤维蛋白 纳米金(AuNPs)可调且较宽的吸收带与许多荧光供体重合,可用作荧光猝灭剂。本工作将利用纳米金的内滤效应,建立简单、快速、高灵敏检测纤维蛋白的新方法。本工作制备了吸收峰为520 nm的纳米金,可强烈吸收荧光素钠(FAM)的荧光,产生内滤效应。在纤维蛋白的存在下,AuNPs与纤维蛋白相互作用,从而诱导 AuNPs聚集,吸收峰红移,内滤效应降低,荧光恢复。在最优化的条件下,纤维蛋白的浓度在0.125–2.5 nM范围内呈现一个良好的线性关系。回归线方程是ΔF=360.7+92.7c(c是纤维蛋白的浓度,nM),相关系数为0.9989,该方法的最低检出限为40 pM。与传统的荧光检测方法相比,该方法具有快速、简单、方便、易于操作,已成功的应用于人体血浆样品的定量检测。 二、基于单壁碳纳米管降低背景信号高灵敏检测纤维蛋白 本实验基于单壁碳纳米管(SWNTs)良好的荧光猝灭作用,运用荧光分析方法,对纤维蛋白进行高灵敏检测。本实验选用的溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,与Fib相结合,荧光强度增大,与纤维蛋白相结合,荧光强度也可增大。但两者荧光强度相近,难以区分,因此加入SWNTs。SWNTs不仅能吸附与Fib相结合的EB,而且还能吸附游离在溶液中的 EB,使得背景信号降低,荧光被猝灭。加入 SWNTs后,由于纤维蛋白的特殊结构,空间位阻较大,纤维蛋白较难被吸附,所以 SWNTs对荧光的猝灭作用较弱,荧光强度较强。据此可利用SWNTs能够猝灭荧光,降低体系背景信号的作用来对纤维蛋白进行检测。在最优的条件下,纤维蛋白的浓度在1.25-10 pM范围内呈现一个良好的线性关系。回归线方程为ΔF=70.99+4.634C(C是纤维蛋白的浓度,pM),线性相关系数R为0.9921,相对标准偏差的范围在3.5%-6.3%,该方法的最低检出限为0.5 pM。与传统的荧光检测方法相比,该方法省时,简单,方便,易于操作,而且成功的应用于人体血浆样品的定量检测。 三、小檗碱和纤维蛋白的作用研究 小檗碱属于季铵型异喹啉类生物碱,具有极弱荧光性。本工作研究发现纤维蛋白原与小檗碱作用后,产生一个强荧光峰;纤维蛋白也可与小檗碱作用,产生荧光峰。但两者难以区分,因此在实验中引入了SWNTs。首先让SWNTs与Fib和纤维蛋白分别结合然后加入到小檗碱溶液中。Fib缠绕在碳纳米管表面,无法与小檗碱作用,其荧光强度极低;而纤维蛋白的空间位阻大,远离 SWNTs,能够与小檗碱作用,荧光强度大,进而建立了检测纤维蛋白的新方法。在最优化的条件下,纤维蛋白的浓度在125–626 pM范围内呈现一个良好的线性关系,回归线方程为ΔF=54.04+0.125c(c是纤维蛋白的浓度,pM),线性相关系数R为0.9972,该方法的最低检出限为4 pM。