论文部分内容阅读
研究背景前列腺癌是一个重要的公共卫生问题,随着全球人口不断增长和老龄化的加剧,前列腺癌发病率持续地增长。2019年美国前列腺癌新发病例数达174650例,前列腺癌导致患者死亡例数达31620例,是男性第二大死因,仅次于肺和支气管疾病。在我国,前列腺癌发病率虽低于美国等发达国家,但近年来也呈显著的上升趋势。前列腺癌是一种异质性并在男性中高发的肿瘤,其发病的风险因素有很多,例如:年龄、种族、家族史、遗传和肥胖。目前,关于早期的前列腺癌的主要治疗方法包括前列腺癌根治术和放射疗法。然而这些治疗方式并不能阻滞前列腺癌的进展。因此对前列腺癌的发病机制不断加以研究和探索,并研发出一种行之有效治疗方式显得尤为重要。Bromodomain-containing protein 4（溴化结构蛋白 4,BRD4）属于 BET 蛋白家族中的一员,是一种包含溴结构域的蛋白质。BRD4蛋白结合在组蛋白赖氨酸残基上的位点,通过对转录因子、染色质重塑因子和RNA聚合酶Ⅱ活性的调节,从而调控一系列基因的表达。进而参与重要生物活动过程中,如细胞生长、炎症等。在睾丸核蛋白中线癌中的研究中BET蛋白家族的致癌功能首次被证实,而应用BET抑制剂可以产生显著的抗癌作用。随后众多研究中表明BET抑制剂能够抑制肿瘤的进展。因此,明确BRD4在前列腺癌中作用及BET抑制剂对前列腺癌细胞的生物学影响,将有益于我们更好理解其在前列腺癌发生发展中的作用。研究目的1.BRD4在前列腺癌细胞及癌组织中的表达。2.BET抑制剂及沉默BRD4的表达对前列腺癌细胞生物学功能影响。3.BRD4在前列腺癌中产生生物学效应的具体机制。研究方法1.应用starbase V2.0数据库探索BRD4在其他14种癌组织及癌旁正常组织表达差异。2.统计武汉大学人民医院前列腺癌患者资料46例。前列腺癌患者经前列腺癌根治术后同时获取前列腺癌组织标本及其配对的癌旁组织标本。RT-PCR及免疫组化分别检测BRD4表达;分析前列腺癌组织BRD4的表达与患者年龄、术前PSA、Gleason评分、肿瘤分期及转移等指标相关性。3.RT-PCR及Western blot检测前列腺正常上皮细胞株（RWPE-1）及前列腺癌细胞株（PC3、DU145和LNCAP）的BRD4表达水平,进一步量化BRD4在前列腺癌细胞株中的表达关系。4.不同浓度的BET抑制剂JQ1处理前列腺癌细胞。构建并合成沉默BRD4的shRNA,转入DU145及LNCAP细胞系中。细胞存活率应用CCK-8实验检测,细胞周期及凋亡的检测应用流式细胞仪技术,划痕及Transwell侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力。5.RT-PCR及Western blot检测不同浓度JQ1处理前列腺癌细胞或沉默前列腺癌细胞中BRD4的表达后MYC、Bcl-2、P21及Cyclin D1的表达量。构建并合成沉默P21的siRNA,转入DU145及LNCAP细胞中,再分别给予JQ1处理和sh-BRD4处理。RT-PCR及Western blot检测P21及MYC表达量,比较P21及MYC之间的关系。6.RT-PCR及Western blot检测不同浓度JQ1处理前列腺癌细胞或沉默前列腺癌细胞中BRD4的表达后P53和FOXO1的表达量。构建并合成沉默FOXO1的siRNA,转入DU145及LNCAP细胞中,再分别给予JQ1处理和sh-BRD4处理。流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,RT-PCR及Western blot检测FOXO1及P21表达量,比较FOXO1及P21之间的关系。7.构建前列腺癌异位成瘤的裸鼠模型,检测BET抑制剂JQ1及沉默BRD4表达后裸鼠肿瘤的生长。Western blot检测FOXO1、P21和MYC蛋白表达的改变,免疫组织化学技术检测FOXO1及P21的表达。结果1.应用starbase V2.0数据库探索BRD4在其他14种癌组织及癌旁组织表达差异。结果显示在8种肿瘤中,与癌旁正常组织比较,BRD4在癌组织中高表达;2种肿瘤种,与癌旁正常组织比较,BRD4在癌组织中低表达。2.RT-PCR结果提示前列腺癌组织中BRD4表达量总体高于癌旁组织。免疫组织化学染色结果提示癌组织中BRD4表达量明显上调。46例前列腺癌患者病例中,26例前列腺癌患者中BRD4高表达,20例BRD4低表达。其中26例T3/T4期病例中有18例BRD4高表达,20例T1/T2期病例中8例高表达。19例癌转移患者中15例BRD4高表达,27例非癌转移患者中11例高表达。3.RT-PCR及Western blot结果提示与前列腺正常上皮细胞系（RWPE-1）相比较,BRD4在前列腺癌细胞（DU145、PC3和LNCAP）中高表达,并且DU145和LNCAP细胞中BRD4的表达量高于PC3。4.CCK8结果提示BET抑制剂JQ1处理前列腺癌细胞或沉默BRD4表达后的前列腺癌细胞的细胞存活率下降。集落实验提示JQ1处理后或沉默BRD4表达后细胞增殖能力下降。流式细胞技术结果提示前列腺癌细胞经JQ1处理后或沉默BRD4表达后,细胞周期处于G0/G1期细胞明显增多,凋亡细胞增多。划痕及Transwell侵袭实验结果提示前列腺癌细胞经JQ1处理后或沉默BRD4表达后,细胞迁移及侵袭能力下降。5.RT-PCR及Western blot结果提示不同浓度JQ1处理前列腺癌细胞或沉默前列腺癌细胞中BRD4的表达后MYC、Bcl-2表达量下降,P21及Cyclin D1的表达量上调。沉默前列腺癌细胞P21表达后,Western blot结果提示MYC蛋白上调。细胞再经JQ1处理或沉默BRD4后P21蛋白上调,MYC蛋白下调。6.RT-PCR及Western blot结果提示不同浓度JQ1处理前列腺癌细胞或沉默前列腺癌细胞中BRD4的表达后,P53表达无明显变化,FOXO1 mRNA表达上调,但其蛋白表达量明显上调。沉默前列腺癌细胞FOXO1表达后,Western blot结果提示P21蛋白下调,细胞再经JQ1处理或沉默BRD4后FOXO1蛋白上调,P21蛋白上调。7.小鼠成瘤实验提示JQ1处理后或沉默BRD4表达后均可抑制异体肿瘤的生长。Western blot结果提示FOXO1、P21蛋白表达量上调,MYC蛋白下调。免疫组织化学染色提示FOXO1及P21上调。结论1.在前列腺癌细胞及癌组织中,BRD4的表达量呈现为高表达的水平,并且与肿瘤的分期及转移有关。2.BET抑制剂JQ1或沉默BRD4的表达可抑制前列腺癌细胞的活力及增殖,阻滞细胞于G0/G1期,促进癌细胞凋亡,降低癌细胞迁移及转移的能力。3.BET抑制剂JQ1或沉默BRD4表达后通过调控FOXO1-P21-MYC通路,降低前列腺癌细胞活力及抑制细胞增殖,阻滞细胞于G0/G1期,促进癌细胞凋亡。4.BET抑制剂JQ1或沉默BRD4表达后通过调控FOXO1、P21的表达,下调MYC的表达从而抑制异体肿瘤的生长。