辽宁汉族人群IL-1A基因-889、+4716和+4845 SNP位点多态性及法医学意义研究前言单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为继限制性酶切片段多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和短串联重复序列(shorttandem repeat，STR)之后的第三代DNA遗传标记，由于含量丰富、具有较高的遗传稳定性，在法医学领域显示出广阔的应用前景。白细胞介素1(Interleukin-1，IL-1)是一种炎症前期细胞因子。它参与人体的多种生理及病理过程，在炎症和免疫反应中起重要的调节作用。IL-1存在α和β两种配体形式及IL-1r受体形式。IL-1基因簇位于人类第2号染色体长臂1区4带上，包括IL-1A，IL-1B，IL-1RN三个基因区，长约430kb(IL-1A 0 kb～35 kb，IL-1B 70 kb～110 kb，IL-1RN 330 kb～430 kb)。IL-1A基因和IL-1B基因均由7个外显子和6个内含子组成；IL-1RN基因由4个外显子和3个内含子构成。自1986年Yasuji Furutani等报道IL-1A基因全序列至今，在IL-1A基因中已发现了91个SNP位点。目前国内外对IL-1A基因SNP的研究报道较少，且只限于少数几个SNP位点与某些疾病相关性的研究。有关中国北方汉族人群IL-1A基因多态性分布及其法医学应用尚无报道。本研究选择IL-1A基因中3个SNP位点(-889、+4716和+4845)，调查其在中国辽宁地区汉族人群中的遗传多态性，并探讨其法医学意义，为人类遗传学和法医学提供有价值的参考数据。材料和方法一、材料234例静脉抗凝血采自辽宁地区汉族健康无血缘关系的献血者；68个二代三口家系由中国医科大学法医血清学教研室提供。二、主要试剂及仪器蛋白酶K(Takara)；Taq DNA聚合酶，10×Buffer(Takara)；dNTP(Takara)；DNAMarker(北京欣源公司)；丙烯酰胺，N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MERCK)；琼脂糖，三羟甲基氨基甲烷(华美生物工程公司)。DNA扩增仪(UNOⅡ，BIOMETRA)；电泳仪(Pharmacia，EPS 500／400)；电泳槽(北京六一仪器厂，DYY-Ⅲ33A型)；紫外投射光源(Pharmacia LKB，2011 MacroVUE)；高速台式离心机(上海医用分析仪器厂，TGL-16G)。三、方法应用双向等位基因特异性扩增技术(Bi-PASA)结合聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染的方法调查IL-1A基因中3个SNP位点(-889、+4716和+4845)的多态性分布状况，并进行Hardy-Weinberg平衡检验；应用SPSS13.0统计软件进行x~2检验比较不同人群频率分布差异；Odelberg法计算个人识别率(DP)和父权排除概率(PE)，Nei和Chakraborty法计算杂合度(H)。结果IL-1A基因-889位点检出C／T两种等位基因，等位基因频率分别为0.9017和0.0983。2个等位基因组成CC、CT和TT三种基因型，基因型频率分别为0.8077、0.1880和0.0043。IL-1A基因+4716位点检出A／C两种等位基因，等位基因频率分别为0.6325和0.3675。AA、AC和CC三种基因型的频率分别为0.4188、0.4274和0.1538。IL-1A基因+4845位点检出T／G两种等位基因，等位基因频率分别为0.0983和0.9017。TT、TG和GG三种基因型的频率分别为0.0043、0.1880和0.8077。在所分析的68个二代三口家系中，有4个家系不符合生物学遗传关系。其中2个家系的生物学父子关系在3个SNP位点的分析中均被否定；另外2个家系只被+4716一个SNP位点否定了其生物学父子关系。讨论本研究采用双向等位基因特异性扩增(Bi-PASA)方法检测了IL-1A基因中3个SNP位点的多态性。该方法原理是：在一次单个PCR扩增体系中同时加入两对引物，每一对引物针对SNP的一种等位基因进行扩增。第一对引物中的上游引物为非特异性引物，下游引物为等位基因特异性引物，其3′末端正好与SNP位点重合并与两种等位基因中的一种相匹配；第二对引物中的上游引物为等位基因特异性引物，其3′末端正好与SNP位点重合并与两种等位基因中的另一种相匹配，下游引物为非特异性引物。由等位基因特异性引物的3′末端控制着引物的延伸反应，最后根据PCR产物的长度确定等位基因的类型。当SNP位点为野生型和突变型的杂合子时，两条等位基因特异性引物均能发生延伸反应，非等位基因特异性引物之间的一条非特异性产物，杂合子的PCR产物在电泳图谱上为3条谱带。当SNP位点为野生型或突变型的纯合子时，两条等位基因特异性引物中只有一条能够延伸，而两条非特异性引物之间的延伸不受影响，其PCR产物在电泳图谱上为2条谱带。这种方法与PCR-RFLP、PCR-ASA、Taqman、DNA测序等方法相比，具有简单、快速、特异性好、效能高等特点，适合法医学鉴定工作需要。本研究根据IL-1A基因3个SNP位点在中国辽宁汉族群体中等位基因频率的分布状态，计算出各位点的杂合度、个人识别几率、多态性信息量和非父排除概率。结果表明IL-1A-889和+4845 SNP位点的个人识别几率和非父排除率分别为0.3123和0.0807，属于中鉴别能力类遗传标记；+4716 SNP位点杂合度为0.4274、多态性信息量为0.4649、个人识别几率和非父排除概率为0.6182和0.1784，属于高鉴别能力类遗传标记。通过对68个二代三口家系进行上述3个SNP位点的遗传规律调查，在4个被否定了生物学亲子关系家系中，2个家系由3个SNP位点共同排除父权；另外2个家系在一个位点排除父子关系，其余64个家系均未否定生物学亲子关系。此结果与其他检测系统的结果相同，表明本研究方法可以应用于法医学鉴定。我们还将中国辽宁地区汉族群体-889 SNP位点的频率分布与14个不同种族的群体进行比较，结果发现辽宁汉族与中国湖北汉族、广西壮族、亚洲的朝鲜和韩国人群的频率分布无显著性差异(P＞0.05)，而与欧洲、美国白人以及美国黑人群体具有显著性差异(P＜0.05)。结论1、双向等位基因特异性扩增(Bi-PASA)技术具有简单、快速、特异性好、效能高的特点，在法医学研究和鉴定中具有较高的应用价值。2、IL-1A基因-889、+4716和+4845三个SNP位点在辽宁汉族群体中具有遗传多态性，且在该人群中分布达到了Hardy-Weinberg平衡。3、IL-1A基因-889、+4845 SNP位点属于中等鉴别能力遗传标记，+4716 SNP位点属于高鉴别能力遗传标记，可以应用于法医学鉴定工作。4、中国辽宁汉族人群IL-1A基因-889位点等位基因分布与欧、美白人和美国黑人之间具有显著性差异，与亚洲黄种人之间没有显著性差异。