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目的:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤,仅2012年,全世界约新发胃癌989,600例、死亡738,000例,这分别占新发癌症病例数和癌症死亡人数的6.7%和8.8%。尽管改进了手术和辅助治疗方法,但大约1/3的胃癌患者仍会复发;且患者一旦复发,5年总生存率低于25%。因此,鉴定用于诊断和治疗该疾病的新标志物和治疗靶标十分重要。我科既往的研究中鉴定出了一系列对胃癌预后具有预测能力的分子,本研究所涉及的LBH是其中之一。Limb bud and heart development(LBH)是脊椎动物中高度保守的组织特异性转录辅助因子,其调节胚胎发育过程中的多个关键基因的表达。它位于染色体2p23.1,编码一个含有105个氨基酸的小核蛋白。除胚胎组织外,LBH还在成人器官中表达,包括脾,肠,肾,脑和外周神经系统。在心脏发育期间异常表达LBH可导致先天性心脏病,例如部分三体性2p综合征。Rieger等人在2010年首次发现了LBH在癌症中的作用,他们观察到LBH作为Wnt途径的靶基因,抑制乳腺上皮分化并促进Wnt通路介导的肿瘤形成。Chen等人的研究发现,在肝透明细胞癌中LBH的过表达导致了患者的预后不良。Liu等人在鼻咽癌中的研究则发现LBH是一个肿瘤抑制因子,其可以抑制细胞增殖并使细胞周期阻滞于G1/S期。目前在胃癌中尚无关于LBH的研究。本研究拟采用生物信息学、免疫组化法研究LBH的预后作用,并通过体内外实验研究LBH对胃癌细胞生物学行为的影响和作用机制。材料与方法:1.在TCGA-STAD和GSE29272数据集中研究癌与癌旁LBH mRNA表达的差异。2.在TCGA-STAD、GSE15459和GSE29272中通过Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验LBH高、低表达组患者的总生存期差异。3.在TCGA-STAD、GSE15459和GSE62254数据集中运用COX单因素分析和COX多因素比例风险模型分析LBH是否为患者预后的独立预测因子。4.在82例胃癌患者的癌和癌旁组织中通过免疫组化方法检测LBH的蛋白表达水平,判断LBH蛋白在癌和癌旁表达的差异。5.收集82例胃癌患者的临床病理参数和预后信息,分析LBH与患者临床表型和预后间的相关性。6.通过转染慢病毒建立稳定敲减LBH的HGC-27细胞系和稳定过表达LBH的BGC-823细胞系。7.通过qRT-PCR和Western Blot实验验证LBH敲减及过表达效率。8.在胃癌细胞系中通过MTT法和集落形成实验检测LBH对细胞增殖的影响。9.在胃癌细胞系中通过伤口愈合实验和Transwell实验检测LBH对细胞迁移和侵袭的作用。10.通过裸鼠腹腔内注射,判断LBH对腹膜转移的影响。11.在TCGA-STAD、GSE15459和GSE62254数据集中通过基因富集分析(GSEA)研究LBH可能参与的细胞行为和分子通路。12.在TCGA-STAD数据集中利用R软件计算与LBH相关性(Spearman)最强的1000个基因,进行Gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析,以研究LBH所涉及到生物学过程、分子功能和信号通路。13.利用Western Blot法检测敲减或表达LBH后分子通路的变化。14.利用IP实验检测与LBH直接作用的转录因子。15.RNA-seq和Microarray相关的处理和分析采用R软件。16.统计学检验:数据分析采用SPSS18.0软件进行。每组实验重复3次,数据以均值±标准差(±s.d.)表示。采用T检验、Spearman秩和检验比较组间差异。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.在TCGA-STAD和GSE29272数据集中,LBH mRNA在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。2.在TCGA-STAD数据集中,LBH表达与T分期相关;在GSE15459数据集中,LBH的表达与较晚的临床分期、Lauren分型为侵袭型及弥漫性亚型相关。在GSE62254数据集中,LBH与较晚的T、N、M分期均相关。3.在TCGA-STAD、GSE15459和GSE62254数据集中,LBH高表达患者的总生存均显著短于LBH低表达患者。COX多因素比例风险模型均显示LBH为患者预后的独立危险因素。4.针对82例患者的免疫组化分析显示,LBH在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。根据胃癌组织中LBH蛋白水平将患者分为LBH高表达组和LBH低表达组,结果显示LBH高表达患者的预后较LBH低表达组差,差异具有统计学意义(P=0.012)。5.在多种胃癌细胞系中验证LBH表达高低,qRT-PCR结果显示,LBH在MKN-45细胞中表达最高,在HGC-27细胞中次之,在BGC-823细胞中表达最低。Western Blot结果显示,LBH在HGC-27细胞和MKN-45细胞中表达较高,在BGC-823细胞中基本不表达。6.利用慢病毒转染shRNA,建立稳定敲减LBH的HGC-27细胞系。利用慢病毒转染LBH过表达质粒,建立稳定转染LBH的BGC-823细胞系。Western Blot和qRT-PCR均显示敲减及过表达LBH的效率良好。7.与HGC27-NC-shRNA细胞相比,HGC27-LBH-shRNA细胞的增殖能力显著下降,迁移和侵袭能力显著减弱。8.与BGC823-vector细胞相比,BGC823-LBH细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著上升。9.裸鼠腹腔内种植实验显示,与对照组相比,BGC823-LBH的腹腔种植结节数目显著增加,而MKN45-LBH-shRNA组的腹腔内转移瘤数目显著减少,提示LBH可以促进胃癌的腹膜转移。10.在TCGA-STAD、GSE15459和GSE62254中进行的GESA分析发现三个数据集的结果一致性较高,x均提示LBH高表达与“粘着斑”、“细胞外基质-受体相互作用”和“细胞-粘附分子帽”等途径相关。11.在TCGA-STAD数据集中,针对1000个与LBH相关性最高的基因的GO和KEGG分析表明,高LBH表达与PI3K-Akt途径,粘着斑和细胞外基质-受体相互作用有关。12.蛋白质印迹分析显示,敲低LBH显着抑制整合素α1、整合素α5、整合素αV、整合素β1、整合素β3的表达,而过表达LBH则显著增加了整合素α1、整合素α5、整合素αV、整合素β1、整合素β3的表达。13.蛋白印记分析显示,敲减LBH抑制了整合素下游分子p-FAK和p-Akt的表达,但并不改变FAK和AKT的表达。而过表达LBH则促进了p-FAK和p-Akt的表达,但并不影响FAK和AKT的表达。14.蛋白印记分析显示,敲减LBH抑制了NRP1的表达,过表达LBH促进了NRP1的表达。15.免疫共沉淀实验显示,LBH可以与转录因子c-jun结合,利用SP600125抑制c-jun后,显著抑制了LBH过表达引起的NRP1上调。结论:1.LBH在胃癌组织中表达高于癌旁组织。2.LBH与胃癌的不良预后相关。3.LBH促进胃癌细胞的增殖。4.LBH促进胃癌细胞的侵袭和迁移。5.LBH促进胃癌的腹膜转移。6.LBH参与调控Integrin/FAK/Akt通路。7.LBH参与调控c-jun/NRP-1途径。