蜜蜂作为昆虫大家族中的一员,长期以来被视为一个很好的研究对象,而且一直是国内外研究的热点。中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为东方蜜蜂中重要的亚种之一,长期适应于我国的地理特征和气候条件,是我国特有的蜜蜂资源,具有其它蜂种不可替代的资源优势和研究价值。蜂王浆(Royal Jelly,RJ)是哺育蜂咽下腺与上颚腺分泌的供3日龄以内蜜蜂幼虫和蜂王食用的浆状物质。蜂王浆已被报道具有多种医疗保健和生物学功能,对蜂王浆成分及其功能的研究一直是国内外蜂学研究的重要领域。蜂王浆的许多功能由其所含的蛋白组分产生,王浆蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组成,其中水溶性蛋白占总蛋白含量的46％～89％,为王浆蛋白的主要部分,称为主要王浆蛋白(Major Royal Jelly Proteins,MRJPs)。目前,王浆蛋白分子水平方面的研究主要集中在MRJPs家族。　　 本研究从已构建的8日龄中蜂的工蜂头部cDNA文库中筛选到MRJP2基因,成功获得该基因的全长eDNA序列。此序列包含一个1407 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码一个由468个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为53.06kDa,等电点为8.102。本研究首先通过PCR方法从AccMRJP2基因的全长eDNA序列中扩增出整个ORF,再经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后将其插入经同样双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a(+)-AccMRJP2,后通过PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒构建正确后,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达AccMRJP2重组蛋白,最后经SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况,结果显示无特异性条带出现,之后重复多次试验也没有检测到目的蛋白的表达,因此我们随后考虑对AccMRJP2基因进行分段克隆,同时也进行全长基因的表达作为对照。为了避免信号肽可能产生的负作用,我们在进行实验前先将存在于此基因中的信号肽序列去除,并根据需要设计出四对合适的引物,再经PCR扩增出各目的基因片段,长度分别为420 bp、486 bp、498 bp和1356 bp,随后分别构建重组质粒pET-28a(+)-AccMRJP2,并鉴定各重组子是否构建成功,再将各重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,最后经IPTG诱导表达带His标签的AeeMRJP2各片段的融合蛋白及全蛋白,并将其分别命名为His-420、His-486、His-498和His-1356,对应的分子量分别为19.7 kDa、21.5 kDa、22.4 kDa和54.8 kDa(融合标签3.56kDa)。SDS-PAGE检测各融合蛋白的表达情况,结果发现His-420、His-486和His-498均出现各自的特异性条带,但都是以包涵体的形式出现;而His-1356没有出现特异性条带,随后也进行了多次重复实验,始终没有发现目的蛋白的表达。为了进一步探索每种蛋白的最适表达条件,我们也对各融合蛋白的表达条件进行了优化,分别设计了9组在不同诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度条件下的表达实验,同样经SDS-PAGE检测各融合蛋白的表达情况。结果显示,将诱导温度从30℃上升到37℃有利于提高His-420融合蛋白的表达量,而对其它两种蛋白无明显影响;改变IPTG浓度对三种蛋白的表达量影响均不大;此步实验更进一步确定了三种融合蛋白都是以包涵体的形式出现的。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化各融合蛋白,得到的目的蛋白纯度均较高,再经FPLC反相层析柱进一步纯化,最后进行LC-MS质谱分析。质谱结果显示三种融合蛋白均属于AccMRJP2基因的表达产物;另外,纯化的His-420、His-486和His-498经酶解得到的小肽段中,存在有与已报道降血压二肽Ile-Phe(IF,MW=278 Da)分子量接近的肽段,该结果表明AccMRJP2基因分段克隆表达出的三种蛋白的酶解肽段可能成为抗高血压肽的来源之一。