心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVDs）是人类死亡的首要原因,严重危害人类的健康。心血管疾病是全身性、系统性疾病,发病机制复杂多样,但心血管疾病的发生和发展过程一般都伴随着血管硬化。血管硬化在力学性质上表现为血管刚度（stiffness）增加,即血管抵抗弹性形变的能力增加,具体表现为血管受到血流等压力后不容易发生形变,缺乏弹性,增加了血管堵塞和破裂的风险。临床研究证据显示,动脉血管刚度的异常增加会导致心血管疾病的发生和死亡率增加。这提示探究血管刚度改变在心血管疾病发生和发展中的作用及其机制,有望成为阐释心血管病发病机理、改善疾病预后的重要切入点。血管刚度增加的主要原因是构成血管的胶原蛋白增多和弹性蛋白降解,血管壁发生钙化,血管壁中膜的平滑肌细胞大量增殖并向内膜迁移。这一系列血管结构和成分的异常改变导致血管壁力学性能改变,尤其是血管内皮细胞（Endothelial Cells,ECs）的细胞外基质层（Extracellular Matrix,ECM）刚度逐渐增加。研究报道了正常生理状态下内皮细胞外基质层弹性模量约为2.5-8 kPa,心血管疾病状态下可异常增加至30kPa以上。血管内皮细胞是紧密排列于血管内侧的单层细胞,能够合成和分泌多种血管活性物质,维持血管稳态。内皮细胞主要通过产生一氧化氮（Nitric Oxide,NO）和内皮细胞源性内皮素1（Endothelin-1,ET-1）维持血管稳态,两者被认为是反映血管内皮细胞血管活性功能的代表性指标。NO主要由内皮细胞一氧化氮合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS）催化产生,是最重要的舒血管因子。ET-1是内皮细胞产生的一种长效促进血管收缩的内源性多肽。ET-1表达上调能够抑制eNOS表达,减少NO生成,导致血管活性物质稳态失衡和内皮细胞功能障碍,后者是引发心血管疾病的关键因素。因此,细胞外基质层刚度的变化对内皮细胞生成血管活性因子,维持血管稳态功能的调控作用是研究血管刚度增加引起心血管疾病的切入点。目前有研究在体外利用培养基底模拟细胞外基质的力学环境,发现基底刚度的变化能够影响血管内皮细胞的铺展、粘附、增殖及迁移等行为。本实验室前期的研究也发现基底刚度改变可以使内皮细胞传统内参基因表达不稳定性增加。然而,刚度改变对内皮细胞维持血管稳态这一重要功能的影响尚不明确。我们推测刚度增加不利于内皮细胞维持血管稳态的功能,在心血管疾病的发生和发展过程中具有重要的作用。在本研究中,我们通过不同刚度（4,25和50 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶基底模拟病生理状态下内皮细胞的力学环境,培养原代脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）,发现基底刚度增加抑制内皮细胞eNOS的表达,促进ET-1的表达和分泌,提示血管刚度异常增加可诱导内皮细胞功能发生障碍,而力学传导的具体作用机制还需要进一步探究。近年来在心血管疾病发病机制的研究中,微小RNA（microRNA,miRNA）是最受关注的一类小分子,miRNA是非编码短链RNA,能够特异性结合靶基因mRNA链的3’端非翻译区（3’-end untranslated region,3’-UTR）,抑制靶基因表达。为了进一步探究刚度增加引起内皮功能障碍的作用机制,我们以miRNA作为切入点展开研究。我们选取4kPa和50 kPa基底培养的内皮细胞作为样本,利用miRNA芯片分析筛选到差异表达miRNA基因,发现相对于4 kPa基底,50 kPa基底培养的内皮细胞有22条上调miRNA基因,8条下调miRNA基因,其中,生物信息学预测分析发现ET-1可能是hsa-miR-6740-5p（miR-6740）调控的靶基因。通过qPCR验证刚度对miR-6740的调控、双荧光素酶报告基因实验以及向内皮细胞转染人工合成的miR-6740模拟物和抑制物检测ET-1的表达变化,我们发现ET-1是内皮细胞miR-6740作用的靶基因,基底刚度增加显著下调miR-6740,引起ET-1表达和分泌增加。内皮细胞如何感知刚度变化并调控miR-6740和下游ET-1的表达是探明刚度增加引起内皮功能障碍机制需要解决的关键问题。细胞表面的力学感受器是细胞将胞外力学信号转化为胞内生化信号的关键元件。香草素受体4型瞬时感受器电位通道（Transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4）是一种广泛分布在各器官、组织的钙离子通道和力学感受器,内皮、心肌等细胞的TRPV4离子通道在剪切力作用下,能改变通透性促进钙离子(Calcium ion,Ca2+)内流,调控血管紧张与心肌兴奋性。此外,作为细胞第二信使,钙离子也可以通过一系列信号通路影响核内转录因子活性,参与多种基因的调控表达。基于此,我们通过qPCR和细胞免疫荧光对不同刚度基底上内皮细胞TRPV4的表达水平进行检测,利用TRPV4的特异性激活剂GSK1016790A（GSK101）和特异性抑制剂GSK2193847（GSK219）处理内皮细胞,通过钙离子成像和膜片钳实验测定刚度对内皮细胞TRPV4离子通道活性的影响。我们还探究了TRPV4的活性对下游miR-6740和ET-1表达的影响。研究发现:基底刚度增加可抑制内皮细胞TRPV4的表达及其离子通道活性,抑制细胞钙离子内流。抑制TRPV4离子通道活性miR-6740表达下调,ET-1表达上调。激活TRPV4可以促进内皮细胞miR-6740表达,抑制ET-1表达。此外,本研究还对miR-6740是否具有临床生物标志物的应用潜力进行了探究,首先需要明确内皮细胞是否能够胞外分泌miR-6740。由于miRNA是单链RNA小分子,在胞外极不稳定,通常以外泌体的形式存在。内皮细胞上清液外泌体经过抽提、鉴定和miRNA的qPCR检测后,我们发现内皮细胞可以通过外泌体将miR-6740分泌到胞外,且4kPa基底内皮细胞上清液外泌体miR-6740含量显著高于50kPa基底,这提示内皮细胞可以通过外泌体调控血液中miR-6740的水平。接着,我们收集了15例健康人和21例动脉硬化患者的血浆样本,对样本中的miR-6740进行qPCR检测及分析,发现健康人血浆miR-6740含量显著高于动脉粥样硬化患者,血浆miR-6740水平与动脉粥样硬化的发生相关。综合以上,本研究明确了基底刚度增加促进内皮细胞的黏附和骨架生成,促进内皮细胞生成管舒张因子NO,抑制血管收缩因子ET-1的表达和分泌,导致内皮细胞功能障碍。进一步机制研究发现基底刚度通过TRPV4/miR-6740/ET-1力学响应通路调控内皮细胞功能。研究首次发现TRPV4钙离子通道是一种内皮细胞刚度感受器,首次揭示了miR-6740抑制ET-1表达的生物学作用以及血浆中miR-6740与动脉粥样硬化发生的相关性。研究有望为阐明血管刚度增加引发心血管疾病的发病机理提供一定的研究基础,为心血管疾病的生物标志物提供研究参考,为新型血管生物材料的开发和力学特性优化提供理论参考。