论文部分内容阅读
电压门控钠离子通道α亚基第九个成员(Nav1.9)由SCN11A编码，主要表达于外周感觉神经元，能调节静息膜电位(RMP)并放大阈下刺激。本课题组于2013年首次将Nav1.9通道与人类发作性疼痛疾病相关联，随后Nav1.9通道突变被陆续报道于发作性疼痛、小纤维神经病变和术后疼痛等疾病。本研究中新收集了一个发作性疼痛家系，该家系共38人12名患者。患者疼痛主要发作于下肢远端，幼年时发作频繁且随着年龄增长疼痛症状逐渐减轻，劳累、寒冷等因素能诱发疼痛，在该家系中有3名患者表现饮酒诱发疼痛。获得患者知情同意后，通过突变分析发现该家系患者均携带SCN11Ac.664C>A/p.Arg222Ser突变。本课题组之前已报道的一个发作性疼痛家系(致病突变为SCN11Ac.2423C>G/p.Ala808Gly突变)，其中一例患者饮酒也会诱发疼痛，但当时并未进一步研究该诱因。酒中除了水份之外的主要成分是乙醇，在人体乙醇代谢途径中，主要依赖于乙醇脱氢酶(ADH)将乙醇氧化为乙醛，然后乙醛脱氢酶2(ALDH2 )作为最关键的酶将乙醛氧化为乙酸。而有研究表明ALDH2p.Glu504Lys多态位点能明显降低ALDH2酶活，导致携带该多态位点的人饮酒后血液中乙醛大量积累。上述4例患者是否携带该多态，喝酒后体内积累乙醛诱发疼痛呢？Sanger测序结果显示上述4位患者携带ALDH2c.1510G>A/p.Glu504Lys多态位点，而其他患者均不携带该多态位点，从遗传学上表明p.Glu504Lys多态可能是携带SCN11A突变的发作性疼痛患者饮酒诱发疼痛的原因。
为了在体内研究Nav1.9突变导致疼痛疾病及进一步阐释酒精诱发疼痛的机制，本研究利用同源重组技术构建了小鼠Nav1.9(mNav1.9)p.Ala796Gly点突变的knock-in小鼠模型，该突变位点与人类患者携带的Nav1.9(hNav1.9)p.Ala808Gly突变位点一致。通过电压钳实验发现与野生型(WT)通道相比，p.Ala796Gly杂合突变使mNav1.9通道激活曲线向超极化方向偏移6.0mV，而纯合突变使mNav1.9通道激活曲线向超极化方向偏移11.7mV。激活曲线的斜率因子(k)在三者之间没有统计学差异，且稳态快失活的V1/2和斜率因子在三者之间也没有明显差异。但与WT型通道相比，纯合突变的mNav1.9通道通过增加未失活通道明显增加了剩余电流(residual current)，而杂合突变的mNav1.9通道在此方面没有明显差异。这些实验结果表明与WT型和杂合突变的mNav1.9通道相比，纯合突变的mNav1.9通道将会产生较大的窗口电流(window current)，说明纯合突变的mNav1.9通道具有较强的电生理学活性。为了进一步研究p.Ala796Gly突变对Scn11aA796Gknock-in小鼠DRG细胞兴奋性的影响，我们通过电流钳实验发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞动作电位发放频率明显多于WT型小鼠，而Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠DRG细胞动作电位发放频率略高于WT型小鼠，且两者之间没有统计学差异。几种基因型小鼠DRG细胞在静息膜电位和电压阈值(Vthreshold)方面没有统计学差异。此外发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞存在自发放电现象的细胞比例明显高于WT型和杂合型小鼠DRG细胞。以上结果表明p.Ala796Gly纯合突变明显增强DRG细胞兴奋性。
为了确认Scn11aA796Gknock-in小鼠是否具有与发作性疼痛患者类似的表型，我们通过小鼠行为学检测发现：与WT型小鼠相比，Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠表现出机械、热和冷疼痛超敏表型，表明Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠充分模拟了患者疼痛的临床表型。而Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠仅仅表现出热疼痛超敏，且Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠热疼痛阈值高于Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛阈值。为了探究乙醛的积累对小鼠疼痛行为的影响，向小鼠后爪背皮下注射乙醛溶液，发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠舔舐和收缩注射爪的时间明显多于WT型小鼠，且其机械疼痛和热疼痛超敏的持续时间明显延长，而杂合小鼠仅仅在机械疼痛超敏的持续时间延长。向小鼠后爪背皮下注射福尔马林溶液后，Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠的防御性行为总时间明显高于WT型小鼠，而Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠在此方面与WT型小鼠之间没有明显差异。另外乙醛能明显增强突变体mNav1.9通道电流密度，且进一步增强Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞动作电位发放频率。以上结果表明注射乙醛后，Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠模拟了发作性疼痛患者饮酒会诱发疼痛症状，进一步证实了ALDH2p.Glu504Lys多态位点是发作性疼痛患者饮酒诱发疼痛的原因。
患者服用布洛芬能有效缓解疼痛症状，本研究中向Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠灌胃布洛芬，发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛阈值升高，但没有统计学差异。布洛芬为非选择性COX抑制剂，现选择帕瑞昔布(选择性COX2抑制剂)向小鼠尾静脉注射，发现帕瑞昔布能有效缓解Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛超敏症状。而且帕瑞昔布孵育DRG细胞1h后能有效抑制突变体mNav1.9通道电流，降低Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞动作电位发放频率。但在急性条件下帕瑞昔布对突变体mNav1.9通道电流和DRG细胞兴奋性却没有作用。因此COX2介导的炎性通路可以作为未来深入探究发作性疼痛镇痛药物的思考方向。
总之，本研究中新收集了一个发作性疼痛家系，确认患者携带SCN11Ac.664C>A/p.Arg222Ser突变。另外在两个发作性疼痛家系中发现4例患者饮酒诱发疼痛，从遗传学上确认ALDH2c.1510G>A/p.Glu504Lys可能是饮酒诱发患者疼痛的原因；成功构建了一个模拟人类遗传性疼痛疾病的Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠模型，发现p.Ala796Gly纯合突变明显增强DRG细胞兴奋性，导致Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠表现出疼痛超敏表型；进一步证实醛类物质能加剧Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠疼痛表型；确定了COX2抑制剂能有效缓解Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛超敏症状。上述研究为精确诊断发作性疼痛患者复杂的临床表型提供了新的思路，为后续靶向性治疗疼痛奠定了理论基础。
为了在体内研究Nav1.9突变导致疼痛疾病及进一步阐释酒精诱发疼痛的机制，本研究利用同源重组技术构建了小鼠Nav1.9(mNav1.9)p.Ala796Gly点突变的knock-in小鼠模型，该突变位点与人类患者携带的Nav1.9(hNav1.9)p.Ala808Gly突变位点一致。通过电压钳实验发现与野生型(WT)通道相比，p.Ala796Gly杂合突变使mNav1.9通道激活曲线向超极化方向偏移6.0mV，而纯合突变使mNav1.9通道激活曲线向超极化方向偏移11.7mV。激活曲线的斜率因子(k)在三者之间没有统计学差异，且稳态快失活的V1/2和斜率因子在三者之间也没有明显差异。但与WT型通道相比，纯合突变的mNav1.9通道通过增加未失活通道明显增加了剩余电流(residual current)，而杂合突变的mNav1.9通道在此方面没有明显差异。这些实验结果表明与WT型和杂合突变的mNav1.9通道相比，纯合突变的mNav1.9通道将会产生较大的窗口电流(window current)，说明纯合突变的mNav1.9通道具有较强的电生理学活性。为了进一步研究p.Ala796Gly突变对Scn11aA796Gknock-in小鼠DRG细胞兴奋性的影响，我们通过电流钳实验发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞动作电位发放频率明显多于WT型小鼠，而Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠DRG细胞动作电位发放频率略高于WT型小鼠，且两者之间没有统计学差异。几种基因型小鼠DRG细胞在静息膜电位和电压阈值(Vthreshold)方面没有统计学差异。此外发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞存在自发放电现象的细胞比例明显高于WT型和杂合型小鼠DRG细胞。以上结果表明p.Ala796Gly纯合突变明显增强DRG细胞兴奋性。
为了确认Scn11aA796Gknock-in小鼠是否具有与发作性疼痛患者类似的表型，我们通过小鼠行为学检测发现：与WT型小鼠相比，Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠表现出机械、热和冷疼痛超敏表型，表明Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠充分模拟了患者疼痛的临床表型。而Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠仅仅表现出热疼痛超敏，且Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠热疼痛阈值高于Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛阈值。为了探究乙醛的积累对小鼠疼痛行为的影响，向小鼠后爪背皮下注射乙醛溶液，发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠舔舐和收缩注射爪的时间明显多于WT型小鼠，且其机械疼痛和热疼痛超敏的持续时间明显延长，而杂合小鼠仅仅在机械疼痛超敏的持续时间延长。向小鼠后爪背皮下注射福尔马林溶液后，Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠的防御性行为总时间明显高于WT型小鼠，而Scn11a+/A796Gknock-in杂合小鼠在此方面与WT型小鼠之间没有明显差异。另外乙醛能明显增强突变体mNav1.9通道电流密度，且进一步增强Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞动作电位发放频率。以上结果表明注射乙醛后，Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠模拟了发作性疼痛患者饮酒会诱发疼痛症状，进一步证实了ALDH2p.Glu504Lys多态位点是发作性疼痛患者饮酒诱发疼痛的原因。
患者服用布洛芬能有效缓解疼痛症状，本研究中向Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠灌胃布洛芬，发现Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛阈值升高，但没有统计学差异。布洛芬为非选择性COX抑制剂，现选择帕瑞昔布(选择性COX2抑制剂)向小鼠尾静脉注射，发现帕瑞昔布能有效缓解Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛超敏症状。而且帕瑞昔布孵育DRG细胞1h后能有效抑制突变体mNav1.9通道电流，降低Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠DRG细胞动作电位发放频率。但在急性条件下帕瑞昔布对突变体mNav1.9通道电流和DRG细胞兴奋性却没有作用。因此COX2介导的炎性通路可以作为未来深入探究发作性疼痛镇痛药物的思考方向。
总之，本研究中新收集了一个发作性疼痛家系，确认患者携带SCN11Ac.664C>A/p.Arg222Ser突变。另外在两个发作性疼痛家系中发现4例患者饮酒诱发疼痛，从遗传学上确认ALDH2c.1510G>A/p.Glu504Lys可能是饮酒诱发患者疼痛的原因；成功构建了一个模拟人类遗传性疼痛疾病的Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠模型，发现p.Ala796Gly纯合突变明显增强DRG细胞兴奋性，导致Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠表现出疼痛超敏表型；进一步证实醛类物质能加剧Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠疼痛表型；确定了COX2抑制剂能有效缓解Scn11aA796G/A796Gknock-in纯合小鼠热疼痛超敏症状。上述研究为精确诊断发作性疼痛患者复杂的临床表型提供了新的思路，为后续靶向性治疗疼痛奠定了理论基础。