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结核病是由结核分枝杆菌感染导致的传染病,目前仍是威胁人类健康的主要传染病。2014年,世界卫生组织报告结核分枝杆菌引起960万人的感染,并造成150万人死亡。据统计,世界上大概1/3的人感染过结核分枝杆菌,但不是所有的被感染者都会引起结核病,大部分无症状或者症状轻微,为隐性感染,仅约10%的感染者发展为结核病。结核分枝杆菌感染宿主,细菌的毒力和宿主的免疫反应决定了疾病的转归。近些年来,关于病原体的毒力和宿主免疫方面的研究越来越多,但详细机制并不完全清楚。结核分枝杆菌的细胞壁蛋白位于细菌的表面,在结核分枝杆菌进入机体后,易被免疫系统识别,从而参与细菌与宿主免疫的相互作用。已有很多实验表明位于细胞壁表面的蛋白作为毒力因子参与结核分枝杆菌对免疫系统的逃避。在抗结核的非特异性免疫中,巨噬细胞发挥重要的作用,是机体的第一道防线。巨噬细胞将细菌吞入,活化的细胞内的溶酶体可以和含有细菌的吞噬体融合,从而将细菌杀死并降解,并将处理生成的抗原呈递给T细胞,从而成为非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。结核分枝杆菌采用多种策略逃避巨噬细胞的这种杀伤作用,如抑制吞噬体和溶酶体的融合等。目前认为,TNF-a,IL-12及IFN-g是抗结核免疫中最重要的细胞因子,结核分枝杆菌可以抑制宿主细胞产生上述细胞因子,而促进不利于机体免疫的细胞因子的产生,如IL-10。病原菌胞壁的蛋白参与上述的这些免疫调节作用。在蛋白质组学研究中,Rv0431是结核分枝杆菌的胞壁蛋白,并有免疫调节作用,Rv0431敲除的结核分枝杆菌可以促进巨噬细胞产生更多的IL-12,TNF-a和IL-6,这都是有利于机体免疫的。在小鼠体内,敲除Rv0431的病原体在肺内的菌落形成单位明显少于野生株,表现出比野生株减弱的致病能力。还有研究显示Rv0431调节结核分枝杆菌表面囊泡的数量,在这些囊泡中含有TLR2的配体,包括LpqH和SodC,从而影响细菌与宿主免疫的相互作用。过去认为蛋白质的糖基化是真核细胞所特有,近些年的研究表明,在原核生物,比如,放线菌中的分枝杆菌属编码的蛋白,也存在糖基化修饰。最先被证明有糖基化修饰的两个蛋白是结核分枝杆菌的apa和SodC,其中,apa可以同肺泡中的表面蛋白SPA结合,后者是非特异免疫的重要组成成分,apa还可以调节T细胞的功能。Rv0431是细胞壁蛋白,蛋白质组学亲和层析结果显示可能为糖基化修饰的蛋白,已经有研究显示它具有调节宿主免疫的功能,但是关于糖基化及其功能的研究还没见报道。为了深入探讨Rv0431的免疫调节功能及可能存在的糖基化修饰对免疫调节的影响,本课题将从以下三方面展开研究:一、在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌中表达Rv0431,并对Rv0431蛋白O-甘露糖基化进行分析。构建高表达Rv0431蛋白的大肠杆菌（E.coli/Rv0431）和耻垢分枝杆菌（M.smegmatis/Rv0431）,Western blot鉴定表达的Rv0431蛋白,并观察分子量大小。考虑到分枝杆菌属细菌组成中多含有糖及脂,我们在耻垢分枝杆菌中表达Rv0431蛋白,利用甘露糖与Con A-凝集素特异结合的特性来证实Rv10431蛋白是O-甘露糖基化蛋白。对可能的O-甘露糖基化位点进行单点的定向突变,来确立其O-甘露糖基化位点。利于实验室已构建的MS＿5447敲除菌株（（35）M5447）,即甘露糖基转移酶敲除菌株,将pMind-Rv0431表达载体转入,表达纯化蛋白,并再次检测蛋白糖基化情况。二、研究Rv0431及糖基化对巨噬细胞免疫功能的调节。将载有空载体的耻垢分枝杆菌（M.smegmatis/vector）、高表达Rv0431的菌株（M.smegmatis/Rv0431）、以及糖基化位点突变的菌株(M.smegmatis/Rv0431m1-4)与巨噬细胞相互作用,并进行菌落计数,用荧光标记的方法观察吞噬的细菌与溶酶体相互融合的情况,检测Rv0431对巨噬细胞吞噬消化细菌的影响。用酶联免疫吸附试验检测感染重组菌株的巨噬细胞培养上清液中IL-10、IL-12和TNF-α的水平,观察Rv0431对细胞因子产生的影响。三、对Rv0431免疫调节机制作出初步探讨,即通过蛋白质相互作用的技术寻找巨噬细胞表面Rv0431受体。研究Rv0431作为甘露糖基化蛋白在巨噬细胞表面是否有相应的受体,根据受体和配体相互作用的原理,采用标签蛋白沉淀,即pull-down的方法,经银染后研究Rv0431在巨噬细胞表面是否有其受体。本文获得以下结果:一、耻垢分枝杆菌和大肠杆菌中表达的Rv0431蛋白具有不同的分子量,Rv0431是O-甘露糖基化蛋白,糖基化位点为61Thr。1、耻垢分枝杆菌中表达的Rv0431蛋白分子量高于在大肠埃希菌中所纯化的蛋白分子量。SDS-PAGE和Western blot结果显示在耻垢分枝杆菌中表达的蛋白分子量约为25Kd,而在大肠埃希菌中表达的分子量为18Kd,所以在耻垢分枝杆菌中表达的蛋白分子量明显高于在大肠杆菌中表达的蛋白。2、Rv0431是O-甘露糖基化蛋白。M.smegmatis/Rv0431表达的Rv0431蛋白被ConA凝集素识别,说明Rv0431蛋白是甘露糖基化蛋白。Rv0431蛋白具有多个可能的O-甘露糖基化位点,借助软件分析及单点定向突变确定了其O-甘露糖基化位点是61Thr。3、在（35）M5447菌株中表达的Rv0431蛋白无糖基化修饰。在甘露糖基转移酶敲除菌株（35）M5447纯化的Rv0431蛋白失去和Con A结合的能力,因而缺少甘露糖修饰。二、M.smegmatis/Rv0431具有抵抗巨噬细胞杀菌的作用,并调节巨噬细胞产生细胞因子的水平。1.Rv0431提高耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,O-甘露糖基化修饰参与此过程。巨噬细胞杀菌实验显示高表达Rv0431菌株不易和巨噬细胞溶酶体融合,菌落计数表明,M.smegmatis/Rv0431在巨噬细胞内的存活细菌数量高于M.smegmatis/vector,显示出Rv0431有助于细菌抵抗巨噬细胞杀伤作用,而且,M.smegmatis/Rv0431组的菌落形成单位也高于M.smegmatis/Rv0431m3,提示多肽链上的糖基化修饰参与抑制杀菌过程。2.Rv0431提高巨噬细胞产生IL-10,抑制其产生IL-12和TNF-a,O-甘露糖发挥作用。ELISA结果显示M.smegmatis/Rv0431组巨噬细胞产生IL-12和TNF-α低于M.smegmatis/vector组,而产生IL-10的水平则高于M.smegmatis/vector组,说明Rv0431抑制巨噬细胞产生有利于宿主免疫的细胞因子,刺激巨噬细胞产生不利于机体免疫的蛋白因子。与M.smegmatis/Rv0431相比,M.smegmatis/Rv0431m3感染巨噬细胞产生较高水平的IL-12、TNF-a及较低水平的IL-10,这提示我们甘露糖的修饰对细胞因子的生成也有影响,三、Rv0431可能识别巨噬细胞表面甘露糖受体。对蛋白质相互作用的方法即标签蛋白沉淀的方法进行了初步探讨,银染结果显示在170Kd处有蛋白条带,与甘露糖受体分子量一致。结论:1.结核分枝杆菌Rv0431蛋白是O-甘露糖基化蛋白,糖基化位点位于61Thr上。2.Rv0431提高M.smegmatis抵抗巨噬细胞杀菌的能力,抑制巨噬细胞产生IL-12和TNF-a,提高IL-10的生成水平,Rv0431作为毒力因子参与细菌对宿主免疫的逃逸。3.Rv0431发挥上述作用可能通过巨噬细胞表面的甘露糖受体。未来研究方向:1.解析Rv0431蛋白的糖链结构及确定糖链的连接方式。2.进一步确定Rv0431蛋白在巨噬细胞表面的受体,及受体与配体结合引起的信号转导途径,及对炎症因子产生的影响。3.开展动物实验,研究Rv0431在体内的免疫调节作用及机制。