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MSTN是肌肉生长发育的一个重要的负调控因子,是影响体型发育的经典基因之一,其表达量的增加与肌肉量的减少密切相关,抑制MSTN基因的功能,动物会呈现出双肌表型,这对畜牧生产、动物遗传育种、肌肉萎缩性疾病的诊断、治疗和预后等方面具有重要意义,但MSTN是一个在胚胎早期就能表达的基因,胚胎期沉默或敲除MSTN基因会因肌肉过度肥大而造成难产、流产、死胎。实现MSTN基因的可控表达成为发挥MSTN基因应用价值的关键。本研究通过设计MSTN shRNA并验证其基因沉默效率,构建可控表达MSTN shRNA载体,制备高效可诱导MSTN shRNA表达的转基因小鼠模型,利用可控表达转基因小鼠模型研究MSTN对肌肉生长发育的影响,为将可控表达的MSTN基因应用到基因工程育种、药物治疗肌肉萎缩病等方面奠定技术基础,提供有价值的参考。主要研究内容和结果如下：研究一：小鼠MSTN shRNA过表达载体构建及基因沉默效率检测本研究根据小鼠MSTN mRNA序列设计了4对shRNA序列,构建相应的MSTN shRNA过表达载体pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA,利用QRT-PCR、Western blot技术检测shRNA干扰后细胞内MSTN mRNA及蛋白表达水平。结果表明,本研究设计并构建的4个MSTN shRNA过表达载体,在细胞水平都能有效降低MSTN mRNA及蛋白的表达水平,其中转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714载体细胞组基因沉默效率最高,MSTN mRNA和蛋白表达分别下降72%、74%,差异极显著(P<0.01)。研究二：小鼠MSTN shRNA可控表达载体构建及诱导效率检测选取干扰效率最好的shRNA MSTN714构建可控表达载体ptTS-MSTN shRNA,重组载体转染小鼠成肌细胞经G418筛选富集整合有外源载体的细胞,通过强力霉素诱导细胞中MSTN shRNA表达,利用细胞免疫荧光观察细胞内绿色荧光蛋白,利用QRT-PCR、 Western blot技术检测MSTN mRNA及蛋白的表达水平检测诱导效率。结果表明,tTS-MSTN shRNA组细胞和Control组细胞在不添加DOX时,仅检测到少量绿色荧光表达,添加DOX后,GFP蛋白信号显著增强；经DOX诱导后,转染含MSTN shRNA重组载体细胞组MSTN mRNA相对表达水平比未经DOX诱导组及其他对照组细胞中降低70%左右,差异极显著(P<0.01),MSTN蛋白也下降90%左右,其他各组间MSTN mRNA及蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。研究三：可控表达MSTN shRNA转基因小鼠的制备及对小鼠生长发育的评价将tTS-MSTN shRNA载体线性化后,利用显微注射法制备MSTN shRNA可控表达转基因小鼠。利用PCR技术对获得的FO代转基因小鼠进行整合检测,利用QRT-PCR方法检测转基因小鼠体内外源基因tTS的表达。检测结果表明,制备的159只F0代小鼠中得到8只阳性小鼠。选取tTS表达效率最好的转基因小鼠扩繁的后代进行转基因小鼠MSTN shRNA诱导活性、生长状况、繁殖性能、肌肉组织学等进行检测评价。结果表明,经DOX诱导的Tg+DOX组小鼠体重显著低于Tg、WT+DOX、WT组小鼠；所制备的转基因小鼠,DOX诱导前的产仔数(7±0.63&7.2±0.84)和窝存活仔数(6.2±0.75&6.4±0.55)均与同期饲养的正常小鼠(WT)差异不显著(P>0.05)；与未经诱导的MSTN转基因小鼠及正常小鼠相比,加DOX诱导之后的MSTN转基因小鼠肌纤维数目增多、肌纤维横截面积增大。