肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一，也是临床治疗的难题，其中细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必备条件。目前，对于调节细胞迁移和侵袭的相关机制仍知之甚少。细胞内细胞骨架蛋白的动态组装、细胞和细胞外基质之间的黏着变化、周围基质的重塑等以及这些反应在迁移侵袭过程中的协调都涉及复杂的信号调节。JWA（AF070523）基因是本课题组周建伟等发现并克隆的新基因，其编码蛋白是一种新的微管结合蛋白。那么，JWA基因是否涉及肿瘤细胞迁移和侵袭的相关分子机制呢?为此，本研究将致力于探讨JWA基因在人类肿瘤细胞迁移中的作用。目的探讨JWA基因在肿瘤细胞迁移过程中的作用以及相关的分子机制，为进一步深入了解肿瘤的发生、发展和预后，为肿瘤的预防、诊断和治疗提供新的科学依据。方法HeLa（人宫颈癌细胞）、B16（小鼠黑色素瘤细胞）以及HCCLM3（高转移潜能的人肝癌细胞）都是体外研究肿瘤细胞迁移和侵袭的良好实验模型。本研究利用这些细胞在特定的促癌或抑癌剂诱导下细胞骨架肌动蛋白丝重组和迁移能力改变的特性，建立系列体外迁移模型。细胞迁移能力从以下几方面进行评价：（1）通过观察细胞肌动蛋白丝的重组来评价肿瘤细胞迁移能力的改变；（2）通过划痕试验，检测细胞的不定向迁移来评价肿瘤细胞迁移能力；（3）采用穿孔试验，检测细胞的定向迁移来评价肿瘤细胞迁移能力。使用凝胶酶谱和Western blot方法检测JWA及FAK、COX-2等细胞迁移相关基因的表达。并且利用JWA反义寡核苷酸技术下调JWA的表达，以进一步探讨JWA基因在促癌或抑癌剂诱导细胞迁移中的机制。使用免疫荧光技术，探讨JWA在促癌或抑癌剂诱导下调控肌动蛋白丝重组的功能。结果（1） JWA是新的微管相关蛋白，为了解JWA是否类似于传统的MAP，具有肌动蛋白丝结合蛋白的功能，用JWA反义寡核苷酸处理细胞，经G418筛选后，得到稳定的JWA表达缺陷水平的HeLa细胞株（As-HeLa细胞），再观察对细胞肌动蛋白丝重组的影响。结果显示在稳定JWA表达缺陷的HeLa细胞株中，肌动蛋白丝开始重组，细胞的边缘随之伸出一些突触，提示JWA可能是微管和肌动蛋白丝结合蛋白，调节细胞骨架组装。（2）在此基础上，进一步利用促癌剂佛波酯（phorbol ester，PMA）和抑癌剂三氧化二砷（arsenic trioxide，As₂O₃）分别诱导HeLa细胞株肌动蛋白丝重组的细胞模型：8 nM PMA分别处理细胞6，12和24h，免疫荧光显示，在稳定转染JWA空载体（HeLa-vector细胞）的细胞株中，PMA处理6h后，细胞边缘仍未发现突触的形成，肌动蛋白丝并未出现解聚，提示空载体细胞的肌动蛋白丝未发生明显的解聚聚合。而PMA处理12h后，观察到细胞学形态发生改变，肌动蛋白丝开始重组。同样的处理条件下，在稳定转染JWA表达缺陷载体的细胞株中，PMA处理6h后，细胞边缘伸出一定量的突触，提示肌动蛋白丝已经开始重组。PMA处理12h后，肌动蛋白丝发生更加明显的解聚聚合。与转染空载体的细胞相比，JWA表达缺陷的细胞肌动蛋白丝的重组明显加速。10μM As₂O₃处理细胞10，30和60min，免疫荧光同样观察到，JWA表达缺陷的细胞比空载体细胞提前出现肌动蛋白丝的解聚聚合，进一步提示JWA参与细胞肌动蛋白丝的重组过程，并且在促癌或抑癌剂诱导的细胞肌动蛋白丝的解聚聚合中起作用。（3）为了解JWA是否参与肿瘤细胞的迁移，HeLa细胞转染pEGFP-C1，pEGFP-C1-JWA或pEGFP-C1-AsJWA质粒，G418稳定筛选后，得到空载体，JWA高表达（HeLa-JWA细胞）和反义JWA稳定转染的细胞株，免疫印迹鉴定，建立划痕和细胞穿孔试验模型，观察JWA对细胞迁移能力的影响。在划痕模型中结果显示，JWA表达缺陷可促进细胞的伤口愈合，而JWA高表达则抑制伤口的愈合，表明JWA在细胞的非定向迁移中起作用。同样，细胞穿孔实验结果显示，JWA表达缺陷可促进细胞的迁移，而高表达的细胞则起抑制迁移的作用，表明JWA在细胞的定向迁移中起作用。我们用细胞穿孔模型检测了在HCCLM3和B16细胞株中JWA的作用，结果观察到类似的现象，进一步提示JWA在肿瘤细胞的迁移中起重要的作用，JWA可抑制细胞的迁移。（4）为建立As₂O₃诱导细胞迁移的模型，首先用细胞增殖分析试剂盒分析As₂O₃的细胞毒性。结果显示，不同浓度的As₂O₃处理空载体和反义JWA稳定转染的HeLa细胞48h后，有血清处理的细胞均出现明显的细胞毒性，2μM As₂O₃处理的HeLa细胞大约50％出现生长抑制现象；但在无血清的情况下，As₂O₃浓度低于2μM诱导并未观察到抑制增殖和促进凋亡现象。提示在有血清的情况下，As₂O₃细胞毒性更大，所以选择无血清状态下As₂O₃（1μM）作为模型药物用于研究细胞迁移。（5）不同浓度As₂O₃对细胞迁移作用有着不同的影响：用0.5，1和2μM As₂O₃处理空载体细胞0，1和2d后，划痕结果显示As₂O₃有显著抑制HeLa细胞伤口愈合的作用，且呈剂量依赖性关系。进一步研究发现，PMA（80 nM）能够显著增强As₂O₃抑制细胞迁移的作用，而对As₂O₃诱导的细胞凋亡和生长抑制没有显著影响。PMA（80 nM）与不同浓度的As₂O₃（0，0.5，1和2μM）序贯处理空载体细胞24h后，划痕试验结果显示As₂O₃呈剂量依赖性的抑制PMA诱导的HeLa细胞的伤口愈合。在相同的处理条件下，细胞穿孔试验也显示同样的结果。（6）为探讨JWA参与细胞迁移的调控机制，考虑到药物诱导迁移的有效性及对细胞的毒性作用，我们选用PMA（80 nM）与1μM As₂O₃序贯处理空载体和反义JWA稳定转染的HeLa细胞。结果表明PMA能够显著增强HeLa细胞的迁移能力，而As₂O₃则明显抑制PMA诱导的HeLa细胞迁移，JWA基因表达下调后，能显著减弱As₂O₃对HeLa细胞迁移的抑制作用，同时促进PMA诱导的细胞迁移，这些结果进一步证明JWA可能作为信号分子参与细胞迁移的信号通路调控。（7）在此基础上，为了解JWA是否为模型药物诱导的细胞迁移信号通路所必须，在上述药物诱导迁移的细胞模型中，用western blot检测丝裂原活化蛋白激酶信号通路（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路级联中各级信号分子，即Raf-MEK-ERK和其磷酸化的表达，结果显示在As₂O₃和PMA影响HeLa细胞迁移模型中，Raf-MEK-ERK信号途径被激活（即Raf、MEK、ERK磷酸化），JWA基因表达下调后，MEK和ERK不能被磷酸化，但Raf的磷酸化未受到影响，以上结果强烈提示JWA确有可能通过影响ERK信号通路而调控细胞迁移；其影响环节在于对MEK的调节；PKC可能作为JWA的上游调控因子之一，磷酸化JWA，影响ERK信号通路，进而调控细胞迁移。（8）为阐明JWA在模型药物激活的MEK-ERK信号通路中的作用，我们设计了JWA回复模型。JWA表达缺陷的HeLa细胞瞬转pEGFP-C1-JWA的质粒后得到JWA回复的HeLa细胞（As-HeLa-rescue细胞）。回复模型中，PMA（80 nM）加或不加As₂O₃（1μM）处理空载体和JWA回复的细胞24h后，用western blot检测Raf-MEK-ERK的磷酸化。结果显示，JWA回复细胞中，As₂O₃和PMA诱导的MEK-ERK信号途径被激活，MEK和ERK的磷酸化被回复，但Raf的磷酸化回复并未受到影响，进一步证明JWA通过MEK-ERK级联影响细胞迁移。（9） PMA和As₂O₃独立作用时均能激活MEK／ERK信号通路，但两者对HeLa细胞迁移的影响完全相反（PMA促进迁移，As₂O₃抑制迁移）。为了解JWA是否参与激活了ERK不同的磷酸化位点，进而激活其下游不同的底物，我们用western bolt检测了迁移模型中As₂O₃和PMA诱导的ERK下游不同的底物黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达。结果显示As₂O₃可下调FAK的表达水平而PMA可上调COX-2的表达水平。进一步检测JWA在PMA调节COX-2的表达和As₂O₃调节FAK表达中的作用，结果显示，在As₂O₃和PMA影响HeLa细胞迁移模型中，用PMA（80 nM）处理JWA表达缺陷细胞株后，其相应的ERK下游底物COX-2的表达水平显著上调。而As₂O₃（1μM）处理则引起其相应的ERK下游底物FAK表达的上调。这些结果证明JWA与PMA／As₂O₃激活的MEK-ERK通路，分别调节其相应的ERK下游底物COX-2／FAK的表达，最终引起迁移的不同效应。（10）用JWA回复模型进一步验证JWA在PMA调节COX-2的表达和As₂O₃调节FAK表达中的作用。用PMA（80 nM）加或不加As₂O₃（1μM）处理空载体和JWA回复的细胞24h后，用western blot检测COX-2和FAK的表达。结果显示，随着JWA表达水平的回复，COX-2和FAK的表达均被回复。以上结果提示JWA在PMA和As₂O₃诱导的MEK-ERK-下游底物通路中起重要作用。（11）为探讨JWA是否在MAPK级联中起类似激酶分子的作用，我们设计了系列JWA磷酸化位点突变体。利用基因突变技术，构建了JWA编码区PKC磷酸化位点1、2以及两位点同时突变的三种pEGFP-N1载体，稳定转染，获得相应的三种HeLa细胞株，分别命名为As-HeLa-P1，As-HeLa-P2和As-HeLa-P12细胞株。PMA（80 nM）加或不加As₂O₃（1μM）序贯处理JWA空载体和磷酸化位点突变细胞24h后，用western blot检测MEK，ERK和其相应的下游分子FAK和COX-2的磷酸化水平。结果显示在As-HeLa-P1 HeLa细胞中，As₂O₃和PMA仍可诱导MEK和ERK的磷酸化。PMA诱导的COX-2和As₂O₃诱导的FAK表达被回复。但在As-HeLa-P2 HeLa细胞中，MEK和ERK的磷酸化水平下降。有趣的是，在As-HeLa-P12细胞中，JWA磷酸化位点突变后，As₂O₃或PMA刺激均不能引起MEK和ERK的磷酸化。甚至，PMA诱导的COX-2和As₂O₃诱导的FAK表达水平均不能回复。但JWA磷酸化位点突变并不影响Raf的磷酸化。总之，这些结果说明JWA在As₂O₃和PMA引起的MEK-ERK通路中起重要作用，提示JWA在MAPK通路中可能是介于Raf和MEK的磷酸化底物。（12）为进一步证实JWA磷酸化在迁移中所起的作用，用PMA（80 nM）力口或不加As₂O₃（1μM）分别处理As-HeLa-P12和As-HeLa-rescue细胞后，细胞穿孔试验检测其迁移能力的改变。结果显示，在As-HeLa-rescue细胞中，As₂O₃和PMA诱导的迁移被回复，As-HeLa-P12细胞中结果则相反。因此，JWA蛋白磷酸化位点突变对调节细胞迁移起着重要的作用，但确切证据有待进一步研究提供。讨论JWA参与肿瘤细胞迁移的调节，是促癌或抑癌剂诱导细胞迁移信号转导通路中共同的信号分子，在MAPK信号通路以及肌动蛋白丝的重组过程中起重要的作用。JWA可能是细胞内控制肿瘤细胞转移新的分子标志物。JWA可以抑制HeLa，HCCLM3和B16等肿瘤细胞的迁移，可能在信号通路中同时调控微管和肌动蛋白丝两大细胞骨架系统，引起迁移。在HeLa细胞中，JWA通过调节细胞骨架肌动蛋白丝的重组抑制细胞的迁移；在抑癌剂As₂O₃和促癌剂PMA诱导的肌动蛋白丝的变化中，JWA均起重要的调节作用。JWA还参与MEK-ERK-下游底物的信号通路，可能通过激活ERK的不同磷酸化位点，使促癌或抑癌剂诱导的细胞迁移产生不同的终效应。JWA磷酸化在MAPK信号通路介导的细胞迁移中起重要作用，JWA表达与MEK和ERK的磷酸化有关，但不影响Raf，功能上类似于一个MAPKKK分子。对JWA基因功能深入、全面的探讨有助于我们进一步了解肿瘤的发生、发展和预后，为肿瘤的预防、诊断和治疗奠定理论基础。