研究背景:随着社会经济的发展和人类生活方式的转变,超重及肥胖(obesity)已经成为一个严重的社会问题。研究表明,肥胖是导致多种疾病发生的独立且重要的危险因素,也是诱发糖尿病、心脑血管疾病等多种代谢相关疾病的危险因素之一。肥胖主要表现为体内白色脂肪组织(WAT)含量增多,且多项研究表明脂肪细胞分化异常以及代谢障碍与肥胖、糖尿病等代谢类疾病的发生和发展关系密切,因此研究脂肪细胞分化与代谢异常的分子机制对于防治肥胖及其相关疾病具有重要意义。CIDE家族(cell death-inducing DFF45-like effectors)是上世纪末发现的一组能够诱导细胞凋亡的新基因。该家族主要包括有三个成员:CIDEA,CIDEB和CIDEC,CIDEC在小鼠称为脂肪特异性蛋白(fat specific protein 27,Fsp27)。有研究表明:CIDEA、CIDEB与Fsp27基因与肥胖发生发展密切相关;CIDE家族基因敲除的小鼠均能抵制高脂饮食所诱导的肥胖。其中,Fsp27仅在成熟的脂肪细胞中表达,与脂肪细胞的分化密切相关,并且具有促进脂肪储积和抑制脂肪分解的作用。我们前期实验已证实CIDEC与脂肪细胞分化密切相关:在脂肪细胞分化过程中CIDEC的表达逐渐升高;而敲除CIDEC基因后,脂肪细胞内脂滴不能增大,甘油三酯含量减少,脂肪分解速度加快。然而,CIDEC调控脂肪细胞分化的具体机制尚不明确。我们前期通过酵母双杂交试验发现CIDEC可能与AMPK存在着直接相互作用。AMPK是细胞及整个机体的代谢感受器,发挥维持能量稳态的作用。在脂肪组织中,AMPK通过控制脂肪酸氧化、糖摄取和脂肪分解等来调节能量稳态。但CIDEC与AMPK相互作用对AMPK活性的影响,以及对脂肪细胞分化过程的影响尚不清楚。因此本课题将继续进一步探讨AMPK在CIDEC促进人脂肪细胞分化过程中的作用,以及研究CIDEC与AMPK在这一过程中的相互作用关系及作用机制,深入阐明脂肪细胞分化的分子机制。研究目的:在已有的研究基础之上,通过探讨CIDEC与AMPK在脂肪细胞分化中的相互作用关系,以及对AMPK表达水平和活性的影响,进一步阐明CIDEC调控脂肪细胞分化的分子机制,为肥胖发生及其防治提供理论依据。研究方法:1通过免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot等方法分析AMPKα和CIDEC在脂肪细胞分化中的作用,明确二者的相关性。2分别构建CIDEC(或AMPKα)过表达与抑制表达的病毒体系和质粒体系,感染或转染活细胞,以研究CIDEC是否通过与AMPKα作用而促进脂肪细胞分化。3通过免疫荧光和免疫共沉淀实验明确CIDEC与AMPKα是否存在直接相互作用及二者相互作用的亚细胞定位;并通过放线菌酮蛋白降解实验和蛋白酶体抑制实验以明确蛋白质发生降解的具体方式。研究结果:1.AMPKα的表达水平与脂肪细胞的分化具有相关性,且与CIDEC表达水平负相关。我们使用免疫组化、Real-time PCR和Western Blot等方法首次在人体脂肪组织和细胞中检测了AMPKα的表达变化,结果显示:在不同分化程度的脂肪源性肿瘤组织中,AMPKα表达随着脂肪细胞分化程度的升高而表达降低;在不同发育阶段的胎儿脂肪组织中,AMPKα随着胎龄的增加表达逐渐降低;在原代培养的人前脂肪细胞诱导分化成熟过程中,AMPKα的表达逐渐降低。以上AMPKα的表达均与CIDEC的表达水平呈负相关。2.在脂肪细胞分化过程中,CIDEC可能通过抑制AMPKα的表达而促进脂肪细胞分化。我们在原代培养的人脂肪细胞和293T细胞内均发现过表达CIDEC基因后AMPKα的表达与活性均显著降低;同时,沉默CIDEC基因后,脂肪细胞内AMPKα的表达升高并且持续激活。这些结果说明CIDEC可能通过某种途径降解了AMPKα的表达,继而促进了脂肪细胞分化。3.CIDEC与AMPKα在活细胞内存在直接相互作用关系,且CIDEC可能通过激活泛素化-蛋白酶体途径而将AMPKα降解失活。通过免疫荧光实验,我们发现内源性和外源性CIDEC与AMPKα均存在共定位。进一步,我们通过免疫共沉淀实验证实CIDEC与AMPKα1和AMPKα2亚基能够直接相互作用。此外,放线菌酮蛋白降解实验表明CIDEC可引起AMPKα的降解;蛋白酶体抑制实验和免疫沉淀实验均表明CIDEC可引起AMPKα的泛素化,推测其可能通过泛素-蛋白酶体通路将AMPKα所降解。这些结果提示,在脂肪细胞中,CIDEC可能通过降解AMPKα从而促进了脂肪细胞进一步分化。结论:本研究中,我们在已有的研究基础之上通过探讨CIDEC与AMPKα在脂肪细胞分化中的作用以及分析二者的相互作用关系,阐明在脂肪细胞分化过程中,CIDEC通过与AMPKα相互作用,并可能通过泛素化-蛋白酶体途径介导了AMPKα的降解,从而促进了脂肪细胞进一步分化成熟。