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近年来,随着人类免疫学的快速发展和相关知识的不断深入,嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)已经成为细胞免疫治疗领域的一项突破性技术,并有望成为肿瘤治疗的有力工具。这是一种新型的输入型药物,通过输入基因工程化的淋巴细胞来调节抗肿瘤作用,而不会对正常组织造成任何损害。尽管这种细胞疗法已在治疗血液肿瘤领域取得惊人的结果,但在针对实体瘤治疗方面,CAR-T仍存在一些负调节因子(如PD-1受体)在免疫细胞激活后抑制其抗肿瘤反应。PD-1主要通过与肿瘤细胞上的同源配体结合来抑制T细胞活性,促使T细胞发生功能障碍和衰竭。此外,CAR-T细胞在体内扩增后出现的细胞因子释放综合征(CRS),CRS主要由IL-6水平升高引起,IL-6的升高也是CRS发生的一个特征。严重的CRS也被认为是威胁生命的一个因素。同时,靶向这些负调控因子的抗体可以阻断抑制作用,大幅提高疗效,但T细胞的非特异性激活会延缓免疫反应并出现严重不良事件。有趣的是,RNA干扰(RNA interference,RNAi)也许是一种可以阻断抑制性受体PD-1和CRS相关IL-6受体胞内在通路的有效手段,因为RNAi可以特异性地插入到“非药”基因中。因此,本课题拟研究以具有RNAi效应的shRNA改造T细胞,下调PD-1基因表达以释放自然免疫系统的“刹车”和下调IL-6基因表达以降低严重CRS的发生率,提高临床治疗的安全性。本项目将分别用含有PD-1和IL-6 shRNA的慢病毒感染T细胞(Jurkat细胞),目标是分析PD-1和IL-6基因的敲除效率。shRNA技术抑制PD-1和IL-6在效应T细胞上的表达,可以提高其抗癌作用,并取得显著的持续疗效。为了实施本项目,我们设计了编码PD-1和IL-6融合的慢病毒(LV),并将其转导进jurkat效应细胞中以产生分别过表达PD-1和IL-6的稳定细胞株。荧光显微镜和qRT-PCR结果证实PD-1和IL-6在jurkat细胞中成功稳定表达。然后分别设计出针对PD-1和IL-6基因的含8种shRNA结构的重组LV(rLV)。含shRNA寡核苷酸的rLV被转导到相应的jurkat过表达细胞,以评估其敲减效率从而选择有效的shRNA。通过qPCR检测评估shRNA转导细胞的mRNA水平,发现shRNA降低了约50%的PD-1蛋白表达和40%的IL-6表达。结果表明,rLV可以成功地用于效应细胞的基因传递和基因敲减研究。本课题建立了通过rLV基因转导技术研究下调T效应细胞中PD-1和IL-6基因表达平台,为进一步完善CART细胞在治疗实体瘤的疗效和降低CART临床治疗中严重CRS的发生率提供了新的思路。本课题不足之处是携带shRNA的LV技术介导的T效应细胞基因沉默还没有在体内得到进一步的验证和完善。