广西产拳卷地钱资源与品质的研究

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广西产拳卷地钱(Marchantia convluta Gao et Chang)做为一种常见草药在广西民间使用较广。其常被用来治疗黄疸性肝炎、烧烫伤,跌打损伤,体癣、疮病不敛等。前期研究发现拳卷地钱中的黄酮类化合物具有显著生理活性,不同产地的拳卷地钱药材品质差异较大,特别是总黄酮的含量差异明显,拳卷地钱药材主要来源于野生,其野生资源缺乏,迫切需要对其研究开发和保护,鉴别优质资源的产地,筛选优质种源进行人工驯化。鉴此,本文开展了广西产拳卷地钱资源与品质的研究。1.对广西产拳卷地钱资源分布进行了调查;2.对广西产拳卷地钱总黄酮对CCl4诱导的急性肝损伤大鼠的保肝效用及其作用机制进行研究;3.采用SAM法设计开发广西产拳卷地钱的SSR引物,为其分子生药学鉴别提供基础;4.优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系;5.采用原子吸收分光光度法和原子荧光分析法对其所含重金属进行安全限量检测;利用气相色谱法对其农残进行安全限量检测。6.采用高效液相色谱法对广西产拳卷地钱进行研究,提供其指纹图谱。研究结果摘要如下:1通过资源调查发现,拳卷地钱在广西自治区分布较广,并确定了资源丰富的十一个产地:崇左市市区中渡村、崇左市龙州县小连城自然保护区、河池市九龙公园、河池市都安县、河池市南丹县老圩场村、南宁扶绥县金鸡村、南宁市高峰林场、玉林市兴业县、桂林市平乐县南洲村、百色市隆林县新州镇民强村、百色市永乐镇澄碧湖水库。2广西产拳卷地钱总黄酮对CCl4诱导的急性肝损伤大鼠的保肝效用及其作用机制:2.1与模型对照组比较,拳卷地钱总黄酮组大鼠血清中SOD活性升高,MDA含量减少,GSH-Px活性无明显差异,提示拳卷地钱总黄酮可能通过抑制脂质过氧化反应而发挥保护肝脏的作用。2.2与模型对照组比较,广西产拳卷地钱总黄酮组大鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降,提示广西产拳卷地钱总黄酮可能通过抑制炎症而发挥保护肝脏的作用。2.3与模型对照组比较,广西产拳卷地钱总黄酮组血清ALT和AST降低,病理切片也表明肝组织受损较轻。以上研究结果表明,广西产拳卷地钱总黄酮对CCl4致急性肝损伤大鼠具有保肝护肝的作用,其药效机制可能与抑制脂质过氧化、抗炎作用有关。3利用SAM法设计了广西产拳卷地钱的SSR引物:利用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA,经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段,将扩增产物连接转化到大肠杆菌,筛选得到阳性克隆进行测序,得到适合用来设计SSR引物的86条序列。通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物30对,摸清了最优参数和关键技术,为鉴别广西产拳卷地钱提供了分子生药学实验基础。以上实验研究填补了国内在广西产拳卷地钱研究领域的空白,为开发利用广西产拳卷地钱资源打下了基础。4优化了广西产拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。拳卷地钱最佳反应体系(20μl)为:250μmol/L dNTP,1.6 mmol/L Mg2+,0.6μmol/L引物,0.75 U Taq DNA聚合酶,50 ng模扳DNA。5广西产拳卷地钱中重金属及农残检测结果为:镉含量(0.38mg/kg)、铅(16.73mg/kg)、铁(9.49g/kg)、铜(34.01mg/kg)、汞(0.12mg/kg);总六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)未检出;总滴滴涕(pp’-DDE、pp’-DDD、op’-DDT、pp’-DDT之和)未检出;五氯硝基苯未检出,提示重金属铅、铁、铜超标。首次对广西产拳卷地钱进行了重金属及农残的安全性评价。6八批广西不同产地拳卷地钱药材的HPLC指纹图谱建立的条件:ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈(B)-0.1%磷酸水溶液(D);梯度洗脱:5%→5%B(0-5min),5%→100%B(560min),100%→100%B(6080min);流速:1.0 mL·min-1;检测波长230nm;柱温25℃;进样量20μL。共有峰的相对保留时间基本一致,色谱峰分离良好,不同批次的药材共有峰的相对峰面积则存在着较大的差异,相似度范围为0.9430.774。首次提供广西产拳卷地钱的HPLC指纹图谱。
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