研究背景神经病理性疼痛是神经系统原发性损伤或功能异常所导致的痛觉异常或痛觉过敏。创伤、缺血性损伤、感染或炎症、肿瘤、药物和压迫等原因均可以引起神经病理性疼痛。非甾体类抗炎药和阿片类镇痛药治疗神经病理性疼痛的效果差,临床上常使用三环类抗抑郁药和抗癫痫药物进行治疗,但疗效差,副作用大,能够有效缓解50%以上疼痛症状的患者不足50%。因此寻找一种安全有效、作用持久的镇痛方法已成为神经病理性疼痛研究的重要方向。神经病理性痛的受体机制研究表明,神经元和神经胶质细胞膜上的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)表达上调或过度激活可引起中枢敏感化,在神经病理性痛的产生如自发性痛,触诱发痛及痛觉过敏等起重要作用。NMDA受体拮抗机如氯胺酮、MK-801等对神经病理性痛具有良好的镇痛作用,但由于这些药物具有如认知功能障碍、神经空泡样改变等副作用等限制了它们的临床应用。近期的研究表明,NMDA受体的亚型——NR2B型NMDA受体(NR2B)在体内呈选择性分布如主要分布于脊髓背角、前脑等与痛传递和痛情绪有关的区域,与痛感觉和痛情绪的形成密切相关,这提示NR2B可能是一个潜在的镇痛治疗的靶点。现在疫苗技术的发展不仅针对外源性抗原开发出各种疫苗,而且能对机体自身抗原制备特异性疫苗,如最近利用肿瘤细胞表面的特异性位点研制的疫苗已被证实能有效地预防和治疗癌症地发生发展。During等构建的NMDAR1表位疫苗为防治中风和癫痫后脑损伤提供了新的治疗策略。据此,我们的假设:以NR2B为抗原制备疫苗诱导机体产生NR2B抗体,该抗体与神经元或胶质细胞膜上的NR2B结合,下调NR2B的表达或阻断NR2B的激活,发挥镇痛作用。因此,本研究旨在首先观察NR2B多肽疫苗对神经病理性痛大鼠的免疫效应及镇痛效应,然后构建NR2B重组腺病毒(Recombinant adenovirus serotype 5 encoding NR2B gene, rAd5/NR2B)镇痛疫苗,并通过口服免疫大鼠,以评价其对大鼠神经病理性痛痛感觉和痛情绪的影响。研究方法与结果1、NR2B多肽疫苗对神经病理性痛大鼠的免疫效应及超前镇痛效应方法:选取NR2B有免疫原性的一段氨基酸序列合成多肽,并与大分子蛋白载体匙孔虫戚血蓝蛋白( Keyhole LimpetHemocyanin , KLH)交联制备NR2B多肽疫苗即NR2B-KLH。健康雌性SD大鼠随机分为三组:PBS组、KLH组及NR2B组。分别用PBS+福氏佐剂, KLH+福氏佐剂和NR2B-KLH+福氏佐剂皮下注射三次,每次注射后两周以间接ELISA法检测受免大鼠血清NR2B特异性抗体的滴度,并以免疫组化染色法检测大鼠免疫血清与脊髓背角NR2B蛋白的免疫结合反应。于第三次免疫后一周结扎坐骨神经的胫神经和腓总神经分支,保留腓肠神经分支,建立SD大鼠保留神经损伤性神经病理性痛模型(Spared nerve injury, SNI)。术后隔日以up-down法检测大鼠术侧后爪50%机械缩爪阈值的变化及热痛缩爪时间的变化。分别于术前一天和术后7天经枕骨大孔取脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)10～20μl,以间接ELISA法检测CSF中NR2B抗体滴度。术后7天处死大鼠,取腰段脊髓(L4~6),以免疫组化染色法检测脊髓背角c-Fos阳性神经元数目,并采用Western blotting法检测脊髓背角NR2B蛋白的改变。结果:第二次注射后, NR2B组9只大鼠有6只大鼠出现NR2B抗体(>0.5μg/ml)。第三次注射后9只大鼠均检测到NR2B抗体(>2.2μg/ml),且滴度较第一次明显升高。在第三次注射后14天抗体滴度最高(7.2μg/ml),随后抗体滴度逐渐降低,但初次注射后70天血清仍可检测到NR2B抗体。而PBS组和KLH组未检测到NR2B抗体。免疫组化染色法检测发现NR2B大鼠血清可与大鼠脊髓背角结合呈阳性着色,而其余两组未见着色。与术前比较,术后第7天PBS、KLH及NR2B各组50%缩爪阈值均明显降低(P<0.05);但各组间比较,NR2B组明显高于其余两对照组(P<0.05)。各组术后7天热痛缩爪时间与术前比较均有显著升高(P<0.05),但各组间比较,NR2B组明显低于其余两对照组(P<0.05)。术后7天脊髓背角c-Fos蛋白阳性神经元的数目NR2B组明显低于两对照组(P<0.05)(NR2B组:170±22,PBS组:301±36,KLH组:280±25)。术前NR2B组大鼠脑脊液中NR2B抗体呈阴性,而术后7天呈阳性,而PBS组和KLH组这两个时间点均为阴性。Western blotting法检测发现术后7天NR2B组脊髓背角NR2B蛋白的表达较其余两组明显降低(P<0.05)。2、NR2B多肽疫苗对已发生的大鼠神经病理性痛的镇痛作用方法:选取雌性SD大鼠根据第一部分的方法制作SNI模型,术后每天检测术侧后爪50%机械缩爪阈值的改变。术后7天选取50%机械缩爪阈值与术前比较显著降低的大鼠18只随机分为三组:PBS组、KLH组及NR2B组,按照第一部分的免疫方法皮下免疫三次。第三次免疫后14天比较各组大鼠50%机械缩爪阈值、热痛缩爪时间等改变;处死大鼠取血清,以间接ELISA方法检测血清NR2B抗体滴度,取腰段脊髓以免疫组化方法分析脊髓背角GFAP蛋白的表达及星形胶质细胞的激活状况。提取大鼠腰段脊髓总蛋白以western blotting检测NR2B蛋白表达的改变。结果:经过三次免疫,在第三次免疫后14天NR2B组大鼠血清NR2B抗体的滴度为6.9±2.0μg/ml,而PBS组及KLH组未检测到NR2B抗体。SNI术后第7天,PBS、KLH及NR2B各组大鼠50%缩爪阈值分别为2.5±1.4、2.4±0.9及2.0±0.6( g),而术前分别为13.0±1.9、11.7±2.2及12.6±2.7 (g),较术前明显降低(P<0.05),但各组间比较无统计学差异(P>0.05)。在第三次免疫后14天,NR2B组大鼠50%缩爪阈值为6.8±1.5 (g),而PBS组为3.2±1.3 (g),KLH组为3.7±1.4 (g),NR2B组明显高于两对照组(P<0.05)。术后第7天, PBS、KLH、NR2B各组大鼠热痛缩爪时间分别为9.4±1.9、7.8±2.4和8.2±1.9 ( S),而术前各组分别为2.4±1.0、3.4±1.2、2.2±0.9 (S),较术前明显升高(P<0.05),但各组间比较无统计学差异(P>0.05)。在第三次免疫后14天,各组热痛缩爪时间三组分别为7.9±1.6、7.3±1.9、4.6±1.2 (S),NR2B组明显低于对照组(P<0.05)。第三次免疫后14天NR2B组脊髓背角Ⅰ～Ⅱ星形胶质细胞激活状况明显低于对照组(P<0.05)。PBS、KLH及NR2B各组大鼠经过三次免疫,脊髓背角NR2B蛋白与β-actin相对表达丰度分别为74±19 (%)、55±11 (%)、26±4 (%),NR2B组明显低于对照组(P<0.05)。3、NR2B重组腺病毒镇痛疫苗的构建方法:以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3.1-NR2B获得目的基因NR2B;将NR2B定向克隆入腺病毒穿梭载体pDC515,并行酶切及DNA测序鉴定。在脂质体介导下将pDC515-NR2B转染293细胞,并以RT-PCR及Western blotting方法分别从转录水平和翻译水平检测目的基因NR2B的表达。以携带NR2B基因的腺病毒穿梭质粒p515-NR2B和腺病毒骨架质粒pBHGfrt(del)E1,3FLP共转染腺病毒包装细胞293,连续观察细胞的变化(CPE及病毒空斑的出现)。病毒空斑出现后,挑取病毒空斑再感染293细胞提取病毒DNA、RNA及蛋白,分别以PCR、RT-PCR及western blotting从基因水平、转录水平和蛋白水平对病毒空斑进行鉴定和筛选;经鉴定正确的病毒空斑进行大量扩增和纯化并测定其滴度及纯度,为体内研究做准备。结果:质粒pDC515-NR2B经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后得到4.9kb和3.9kb两条DNA条带,分别与目的片段NR2B和载体片段DC515大小一致,而且进一步行测序鉴定,结果表明NR2B基因正确插入穿梭载体。提取被质粒pDC515-NR2B转染的293细胞的RNA进行RT-PCR反应,RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见大小600bp的特异性DNA条带,而未转染的293细胞未见此条带;提取被转染的293细胞的总蛋白经Western blotting检测可见分子量180kDa大小的蛋白条带,而未转染细胞未见此蛋白条带,这表明NR2B基因可在293细胞表达。以穿梭质粒pDC515-NR2B和骨架质粒pBHGfrt(del)E1,3FLP共转染293细胞,共转染后12天可见293细胞变圆并逐渐从壁上脱落,细胞核占据细胞的大部分即所谓CPE改变;15天后较多出现CPE的细胞聚集在一起形成肉眼可见的病毒空斑。被感染的293细胞经三次冻融、离心,提取NR2B重组腺病毒(recombinant adenovirus type 5 encoding NR2B, rAd5/NR2B)上清。分别以rAd5/NR2B原液、10倍、100倍,100倍稀释液进行PCR反应,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见大小600bp的DNA条带,与阳性对照pDC515-NR2B的结果相同,而阴性对照(未用病毒感染的293细胞上清)未见到相应DNA条带。提取被rAd5/NR2B感染的293细胞的RNA行RT- PCR扩增反应,可扩增出600 bp大小的DNA条带,而未感染病毒rAd5/NR2B的293细胞未扩增出相应条带。提取被腺病毒感染的293细胞的蛋白并行Western blotting检测分析,结果感染病毒rAd5/NR2B的293细胞有180kDa的蛋白条带,而未感染该病毒的293细胞无此蛋白条带。rAd5/NR2B经大量扩增及纯化,病毒滴度为5×1011 (V.P./ml),经HPLC法分析纯度为100%。4、NR2B重组腺病毒疫苗口服免疫对大鼠神经病理性痛的超前镇痛效应方法: rAd5/NR2B(1×108 PFU)口服免疫大鼠,2周后以相同剂量加强免疫一次,空白组和rAd5/EGFP组大鼠分别以PBS和rAd5/EGFP以同样的剂量和同样的方法免疫作为对照,每组16只。初次免疫后1周取4只大鼠处死,取大鼠近段小肠集合淋巴结组织,提取该组织RNA以RT-PCR方法检测NR2B的表达。分别于免疫后2、4、6、8、10、15周截尾法取血0.5～1.0ml离心取血清检测免疫血清NR2B抗体的滴度。免疫组化染色法检测各组血清与大鼠脊髓背角NR2B蛋白的免疫结合反应。加强免疫后2周,结扎大鼠左侧坐骨神经的胫神经和腓总神经分支,保留腓肠神经,建立SNI模型,术后隔日检测大鼠术侧后爪机械痛阈和热痛缩爪时间的改变。术后一周取其中四只大鼠处死,取大鼠腰段脊髓(L4~6)),以免疫组化法检测脊髓背角c-Fos表达的变化。分别于SNI术前一天和SNI术后1周和6周经枕骨大孔取CSF 20～50μl,检测CSF中NR2B抗体滴度。SNI术后6周取4只处死大鼠取腰段脊髓蛋白,检测免疫大鼠脊髓背角NR2B蛋白的表达水平。结果:大鼠经疫苗rAd5/NR2B口服免疫1周后,提取近段小肠集合淋巴结组织RNA,经RT-PCR反应可见600bp大小的NR2B特异性DNA条带,而空白组和rAd5/EGFP组无此条带。初次免疫后2周rAd5/NR2B组大鼠血清NR2B抗体平均滴度为5.5±1.9μg/ml;经加强免疫后2周,NR2B抗体滴度进一步升高为13.4±3.2μg/ml;在免疫后10周内血清NR2B抗体滴度虽略有降低,但仍保持较高水平,免疫后15周血清仍可检测到NR2B抗体存在。而在对应的时间点空白组和rAd5/EGFP组大鼠血清未检测到NR2B抗体存在。免疫组化染色发现,rAd5/NR2B组血清可与脊髓背角NR2B蛋白发生免疫结合反应,呈阳性着色,而对照组未见阳性着色。SNI术后1周受免大鼠脊髓背角c-Fos阳性神经元的数目rAd5/NR2B组显著低于对照组(P<0.05)。自SNI术后1周至SNI术后6周,rAd5/NR2B组50%机械缩爪阈值明显高于对照组(P<0.05),而热痛缩爪时间明显低于对照组(P<0.05)。CSF中NR2B抗体在SNI术前一天各组均为阴性,SNI术后1周和6周天rAd5/NR2B组CSF中NR2B抗体转为阳性,而对照组为阴性。Western blotting结果显示,初次免疫后10周rAd5/NR2B组大鼠脊髓背角NR2B蛋白的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。5、NR2B重组腺病毒疫苗口服免疫对神经病理性大鼠痛情绪反应的影响方法:通过位置偏爱实验,选取24只无位置偏爱的SD大鼠,随机分为三组:空白对照组、rAd5/EGF组以及rAd5/NR2B组,每组8只。rAd5/NR2B口服免疫,剂量1×108PFU,2周后以同样剂量加强免疫一次,此为rAd5/NR2B组。而对照组分别以PBS和rAd5/EGFP,按照同样的剂量和方法免疫。加强免疫后2周,截尾法取血0.5～1.0ml并离心取血清,ELISA法检测血清NR2B抗体的滴度。结扎胫神经和腓总神经,保留腓肠神经,制作SNI模型。SNI术后7天将大鼠放入位置回避箱内进行SNI条件性位置回避(SNI conditioned place avoidance,SNI-CPA)实验。该实验分为预处理期1天,训练期4天和测试期1天,三个阶段,观察并记录大鼠在位置回避箱内停留时间。分别于SNI术前一天和实验结束时经侧脑室取CSF20μl左右,分别以ELISA法和western blotting检测其中NR2B抗体滴度和CSF中NR2B抗体与前脑ACC神经元膜蛋白的自身免疫反应。实验结束处死大鼠取前脑ACC组织,分别以免疫组化方法和western blotting检测前脑ACC组织NR2B蛋白的表达水平。结果:加强免疫后2周,rAd5/NR2B组免疫血清NR2B抗体滴度为13.5±2.3μg/ml,而空白对照组和rAd5/EGFP组血清未检测到NR2B抗体。SNI条件性位置回避时间(预处理期免疫大鼠在条件性位置回避箱停留时间与测试期停留时间的差值为条件性位置回避时间,此值越低提示痛情绪反应越弱)空白组、rAd5/EGFP组以及rAd5/NR2B组分别为198±49,237±40和138±29 (S), rAd5/NR2B组与对照组比较明显降低(P<0.05)。CSF中NR2B抗体滴度检测显示, rAd5/NR2B组在SNI前为阴性,而SNI术后为抗体阳性,而对照组为阴性。western blotting结果表明rAd5/NR2B组CSF可与前脑ACC神经元膜蛋白提取物呈特异性结合反应,而空白对照组和rAd5/EGFP组未见特异性结合反应。ACC组织免疫组化及western blotting结果表明,rAd5/NR2B组大鼠前脑ACC神经元NR2B蛋白的表达较空白对照组和rAd5/EGFP组明显降低(P<0.05)。6、统计学处理采用SPSS12.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差(±S)表示,组内、组间比较采用单因素方差分析;计数资料以率表示,组间比较采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结论NR2B多肽疫苗皮下三次免疫可诱导机体产生针对NR2B的体液性免疫性应答,血清内检测到NR2B抗体。在神经病理性痛时,该抗体可进入脊髓背角与NR2B蛋白结合,下调NR2B蛋白的表达,对神经病理性痛产生超前镇痛作用。对已存在的神经病理性痛,该疫苗皮下免疫也可减轻痛觉过敏。将NR2B基因插入腺病毒载体,成功构建NR2B重组腺病毒疫苗rAd5/NR2B。该疫苗口服免疫可诱导产生高滴度的NR2B抗体,其滴度和持续时间优于多肽疫苗。rAd5/NR2B疫苗口服免疫不但对神经病理性痛痛感觉产生超前镇痛作用,而且对神经病理性痛伴随的痛情绪反应也有抑制作用。研究总结本研究首先采用NR2B多肽疫苗皮下免疫的方式证实,NR2B疫苗不仅可诱导机体产生针对NR2B的体液性免疫应答,而且在神经病理性痛时NR2B抗体可进入脊髓与脊髓背角NR2B结合,产生镇痛作用。针对亚单位疫苗的不足,本研究又将NR2B基因插入腺病毒载体构建NR2B重组腺病毒疫苗rAd5/NR2B,而且分别从痛感觉和痛情绪两方面观察了该疫苗的镇痛效应,为神经病理性痛基因疫苗的治疗提供了理论依据。