宏基因组文库中Ⅰ型聚酮合酶基因的克隆及分析

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微生物是当前生物活性天然产物的重要来源,很要目前临床使用的很多药物均是微生物天然产物及其衍生物,例如头孢菌素,洛伐他汀,雷帕霉素等,而土壤微生物在整个地球生物化学循环及可持续发展中发挥至关重要的作用。据研究表明,地球上至少约有107-109细菌种类,这大大增加了人们可以研究及利用微生物生产天然活性物质的概率。但是,自然界中,只有大约1%的微生物能够在实验室条件下进行培养,这很大程度上限制了环境微生物资源的利用。直接提取环境微生物的总DNA构建文库,并对文库中的天然产物的生物合成基因(簇)进行分析,极大地扩展了微生物基因资源的利用空间,增加了获得新的活性天然产物的机会,这就是宏基因组技术。为了最大程度的发掘及分析从环境微生中物获取天然产物的潜力,我们构建了土壤微生物宏基因组文库,并对文库中的聚酮合酶相关基因进行了克隆分析。聚酮类化合物(Polyketides,PKs)是天然产物中重要的组成部分,其主要由聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)合成。其中Ⅰ型聚酮合酶主要为模块性结构,每个模块由不同结构域组成。至少有三分之一以上的天然产物及其衍生物,都是聚酮类化合物。以云南土壤为样品材料,得到环境微生物总DNA(environmental DNA,eDNA),构建了云南土壤宏基因组文库,从土壤宏基因组的角度对环境土壤微生物中的Ⅰ型聚酮合酶生物合成基因序列进行克隆及分析,以获取与Ⅰ型聚酮合酶相关的生物合成的基因信息,具体结果为:1本课题以云南土壤样品为材料,采用直接提取土壤DNA的方法,得到了高质量的环境微生物总DNA,适合构建cosmid 土壤宏基因组文库。通过对云南土壤宏基因组文库库容量的计算,文库包含107个克隆子,平均插入量为37kb到38kb左右,理论上几乎覆盖了所研究的土壤样品中微生物基因组的所有DNA信息。2通过对Ⅰ型PKS基因中保守的keto-synthase(KS)结构域的序列分析设计出简并引物,并利用PCR扩增方法,对云南土壤宏基因组文库中的质粒进行初步筛选。再根据这些简并引物筛选得到的序列,设计特异性引物,再次筛选文库菌液,最终得到了 67个含有不同KS序列的Ⅰ型PKS生物合成基因的单克隆。经过对单克隆的初步的测序分析后,得到一个长度为12952bp含有PKS/NRPS杂合的序列,其中含有2个开放阅读框。本课题通过土壤宏基因组的方法,利用同源序列筛选,构建了一种筛选阳性克隆的方法,并筛选得到了 67个含有KS保守序列的阳性克隆,其中有一个含PKS/NRPS杂合结构的基因。本课题对利用土壤宏基因组方法筛选得到新型聚酮合酶基因的可行性进行了充分的验证,并为进一步研究Ⅰ型聚酮合酶基因及其可能产生的新型聚酮化合物奠定了坚实的基础,也为微生物资源的利用,药物发掘及其功能基因的研究探索了新的途径。
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