1研究目的采用第三代运动训练装置对果蝇进行规律攀爬运动干预,对果蝇高脂膳食干预,采用UAS-Ga14系统对果蝇心脏dSir2、Nmnat基因进行表达或突变调控。通过检测果蝇心脏功能,心肌NAD+-dSir2/Nmnat信号通路相关指标,心肌TAG水平和氧化应激水平,心肌NAD+-dSir2/Nmnat信号通路相关基因表达和心肌脂质代谢相关基因的表达,以探究:(1)规律攀爬运动对高脂膳食果蝇心肌脂质毒性损伤和心脏NAD+-dSir2/Nmnat通路的影响;(2)心脏dSir2、Nmnat基因表达改变对心脏脂质代谢和NAD+-dSir2/Nmnat通路的影响;(3)规律攀爬运动对心脏dSir2、Nmnat基因敲减或突变果蝇诱发心脏脂毒性损伤和NAD+-dSir2/Nmnat通路的影响。为NAD+-dSir2/Nmnat信号通路能介导运动抵抗或改善心肌脂质毒性损伤提供理论依据。2研究方法2.1野生型W1118与雌性hand-Gal4杂交及分组雄性野生型w1118与雌性hand-Gal4杂交,收集F1代处女蝇,分为安静组、运动组、高脂组、高脂运动组。1周龄实验组从第2天龄开始训练或高脂膳食;3周龄实验组从15天龄开始训练或高脂膳食;5周龄实验组从29天龄开始训练或高脂膳食;1周幼龄果蝇和3周成龄果蝇每次翻转到试管底部后给予果蝇10秒钟做规律攀爬运动,5周老龄果蝇每次翻转在试管底部后给予15秒钟做规律攀爬运动。每次运动1.5小时,运动和高脂均连续5天,运动方案结束24时后取材。2.2心脏dSir2和Nmnat基因表达改变及分组雄性野生型w1119与雌性hand-Gal4杂交,收集F1代处女蝇,为正常表达组;dSir2-UAS-overexpression与雄性hand-Gal4杂交,收集F1 代dSir2-UAS-overexpression>hand-Ga14 组处女蝇,分为dSir2过表达组和dSir2过表达高脂组;dSir2-UAS-RNAi与雄性hand-Gal4杂交,收集F1代dSir2-UAS-RNAi>hand-Ga14组处女蝇,为dSir2-RNAi组和dSir2-RNAi运动组;杂合突变体Sirtl5.26cn1(雄性)和Sirtl4.5 cn1/SM6b,P｛eve-lacZ8.0｝SB1(雌性)杂交,收集 F1 代dSir2-mutation纯合突变处女蝇,为dSir2突变组和dSir2突变运动组;将F1代dSir2过表达雄性果蝇与F1代dSir2突变雌性果蝇杂交,收集F2代处女蝇为dSir2,拯救组;Nmnat-UAS-overexpression与雄性hand-Gal4杂交,收集F1代Nmnat-UAS-overexpression>hand-Gal4组处女蝇,分为Nmnat过表达组和Nmnat过表达高脂组;Nmnat-UAS-RNAi 与雄性hand-Gal4 杂交,收集 F1 代Nmnat-UAS-RNAi>hand-Gal4组处女蝇,分为Nmnat-RNAi 组和Nmnat-RNAi运动组;将F1代Nmnat基因过表达雄性果蝇与F1代dSir2突变雌性果蝇杂交,收集F2代处女蝇为Nmnat拯救组。5周龄高脂组从29天龄开始高脂膳食,连续5天高脂膳食,膳食方案结束24时后取材。指标检测:M-mode检测果蝇心脏功能;Western-Blot检测dsir2蛋白水平;ELISA检测果蝇全身和心脏TAG水平、心脏NAD+水平、dSIR2去乙酰化水平、SOD活力水平和MDA水平;显微图像观察心脏周围脂肪组织堆积情况,油红O染色观察心肌细胞内脂滴堆积情况;透射电镜观察心肌细胞肌原纤维和线粒体超微结构情况;qRT-PCR 检测果蝇心脏dSir2、Nmnat、dFoxo、PGC-1、dTOR、Col4al、bmm、dFAS基因mRNA表达;果蝇攀爬能力测量和生命周期统计。3研究结果3.1规律运动、高脂膳食以及二者联合对果蝇心脏脂质毒性损伤、心脏NAD+-dSir2/Nmnat通路以及攀爬和果蝇寿命的影响3.1.1 M-mode检测5周龄果蝇心脏功能结果与安静组相比,运动组心率降低(P<0.05),缩短分数增加(p<0.01),心律不齐指数无显著差异(P>0.05),纤维性振颤降低(P<0.05);高脂组心率增加(p<0.05),缩短分数减少(P<0.01),心律不齐指数升高(P<0.01),纤维性振颤升高(P<0.01);高脂运动组心率无显著变化(p>0.05),缩短分数无显著变化(p>0.05),心律不齐指数无显著变化(P>0.05),纤维性振颤无显著变化(P>0.05)。与高脂组相比,高脂运动组心率降低(P<0.01),缩短分数增加(P<0.01),心律不齐指数减少(p<0.05),纤维性振颤减少(P<0.05)。3.1.2 Western-Blot检测5周龄果蝇心脏dSIR2蛋白水平以及ELISA检测心脏各指标结果与安静组相比,运动组心脏TAG水平降低(P<0.01),dSIR2蛋白去乙酰化水平升高(P<0.01),NAD+水平升高(P<0.01),SOD活力水平升高(P<0.01),MDA水平降低(P<0.01),dSIR2蛋白水平升高(P<0.01);高脂组心脏TAG水平升高(P<0.01),dSIR2蛋白去乙酰化水平降低(P<0.01,NAD+水平减少(P<0.05),SOD活力水平降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.05),dSIR2蛋白水平降低(P<0.01);高脂运动组TAG水平降低(P<0.01),dSIR2蛋白去乙酰化水平升高(P<0.01),NAD+水平升高(P<0.05),SOD活力水平无显著差异(P>0.05),MDA水平无显著差异(P>0.05),dSIR2蛋白水平无显著差异(P>0.05)。与高脂组相比,高脂运动组心脏TAG水平降低(P<0.01),dSIR2蛋白去乙酰化水平升高(P<0.01),NAD+水平升高(P<0.01),SOD活力水平升高(P<0.01),MDA水平降低(P<0.01),dSIR2蛋白水平升高(P<0.01)。3.1.3心脏油红O染色、透射电镜以及显微图像观察对果蝇心脏进行油红O染色,观察到高脂膳食能明显使心脏内形成脂滴堆积现象,而规律运动能减少心脏内脂滴的堆积,并防止高脂膳食造成的脂滴过多堆积现象。通过对果蝇心脏进行透射电镜观察,发现高脂组心肌细胞内肌原纤维细小,排列不整齐,方向无规律;线粒体数量少,形态异常,部分基质肿胀甚至形成小空泡;心肌内还有大量的空泡,类似脂滴,影响肌原纤维排列和走向。而运动组和高脂运动组心肌细胞内肌原纤维体积大,排列整齐,方向有规律性;线粒体数量多,体积相对大。从果蝇心脏显微图像可以明显看出,高脂组心脏周围脂质堆积增多,并且脂质黏连副心肌细胞严重,而安静组、运动组、高脂运动组未发生此现象。3.1.4 qRT-PCR检测5周龄果蝇心脏基因表达结果与安静组相比,运动组心脏Nmnat mRNA水平上调(P<0.01),dSir2mRNA表达水平上调(P<0.01),dFoxo mRNA水平上调(P<0.01),PGC-1 mRNA水平上调(P<0.01),dTOR mRNA 表下调(P<0.01),Col4almRNA 水平下调(P<0.05),bmmmRNA 表达水平上调(P<0.01),dFASmRNA表达上调(P<0.01),dFAS/bmm 表达比值减少;高脂组Nmnat mRNA水平下调(P<0.05),dSir2mRNA表达水平下调(P<001),dFoxomRNA 水平下调(P<0.05),PGC-1 mRNA水平下调(P<0.05),bmm mRNA表达水平下调(P<0.01),dFASmRNA 表达上调(P<0.01),dTOR mRNA 表上调(P<001),Col4al mRNA水平上调(P<0.01),dFAS/bmm表达比值增加;高脂运动组心脏NmnatmRNA水平上调(P<0.01),dSir2 mRNA表达水平无显著差异(P>0.05),dFoxo mRNA水平表达水平无显著差异(P>0.05),PGC-1 mRNA水平无显著差(P>0.05),bmmmRNA水平下调(P<0.05),dFKmRNA表达水平无显著差异(P>0.05),dTORmRNA表达水平无显著差异(P>0.05),Col4almRNA水平无显著差异(P>0.05),dFAS/bmm表达比值减少。与高脂组相比,高脂运动组NmnatmRNA水平上调(P<0.01),dSir2mRNA表达水平上调(P<0.01),dFoxo mRNA水平上调(P<0.01),PGC-1 mRNA水平上调(P<0.01),bmm mRNA表达水平上调(P<0.01),dFAS mRNA表达下调(P<0.01),dTOR mRNA表下调(P<0.01),Col4al mRNA 水平下调(P<0.01),dFAS/bmm表达比值减少。3.1.5果蝇攀爬能力检测结果在1周龄果蝇中,运动组攀爬指数高于安静组(P<0.01),高脂组攀爬指数与安静组比较无差异(P>0.05),高脂运动组攀爬指数与安静组比较无差异(P>0.05)。高脂运动组攀爬指数高于高脂组(P<0.05)。在3周龄果蝇中,运动组攀爬指数高于安静组(P<0.05),高脂组攀爬指数低于安静组(P<0.01),高脂运动组攀爬指数低于安静组(P<0.01)。高脂运动组攀爬指数高于高脂组(P<0.05)。在5周龄果蝇中,运动组攀爬指数高于安静组(P<0.05),高脂组攀爬指数低于安静组(p<0.01),高脂运动组果蝇攀爬指数低于安静组(P<01),高脂运动组果蝇攀爬指数与高脂组比较无显著差异(P>0.05),高脂运动组攀爬指数低于运动组(P<0.01)。3.1.6果蝇生命周期统计结果运动组生命周期高于安静组(P<0.01),高脂组生命周期低于安静组(P<0.01),高脂运动组生命周期与安静组比较无显著差异(P>0.05)。高脂运动组生命周期高于高脂组(P<0.01)。3.2心脏dSir2和Nmnat基因表达改变对5周龄果蝇心脏功能、心脏脂质毒性损伤、心脏NAD+-dSir2//Nmnat通路的影响3.2.1 M-mode检测果蝇心脏功能结果dSir2-RNAi组果蝇心率升高(P<0.05),缩短分数减小(P<0.05),心律不齐指数增加(P<0.01),纤维性振颤增加(P<0.05);dSir2突变组果蝇心率升高(P<0<01),缩短分数减小(p<0.01),心律不齐指数增加(P<0.01),纤维性振颤增加(P<0.01);dSir2-过表达组果蝇心率降低(P<0.01),缩短分数增加(P<0.01),心律不齐指数无显著差异(P>0.05),纤维性振颤减少(P<0.01);Nmnat-RNAi组果蝇心率升高(P<0.01),缩短分数减小(P<0.01),心律不齐指数增加(P<0.01),纤维性振颤增加(P<0.01);Nmnat-过表达组果蝇心率降低(P<0.05),缩短分数增加(P<0.05),心律不齐指数无显著差(P>0.05),纤维性振颤无显著差(P>0.05)。3.2.2 ELISA检测果蝇心脏各指标结果与正常表达组相比,dSir2-RNAi组心脏的TAG水平升高(P<0.01),NAD+水平降低(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平降低(P<0.01),SOD活力水平降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01);dSir 突变组心脏的TAG水平升高(P<0.01),NAD+水平降低(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平降低(P<0.01),SOD活力水平降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01);dSir2 过表达组心脏的TAG水平降低(P<0.01),NAD+水平升高(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平升高(P<0.01),SOD活力水平升高(P<0.01),MDA水平降低(P<0.01);Nmnat-RNAi组心脏的TAG水平升高(P<0.01),NAD+水平降低(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平降低(P<0.01),SOD活力水平降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01);Nmnat-过表达组心脏的TAG水平降低(P<0.01),NAD+水平升高(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平升高(P<0.01),SOD活力水平升高(P<0.01),MDA水平降低(P<0.01)。3.2..3果蝇心脏qRT-PCR结果与正常表达组相比,dSir2-RNAi组果蝇心脏Nmnat基因mRNA表达下调(P<0.05),dSir2基因mRNA表达下调(P<0.01),dFoxo基因mRNA表达下调(P<0.01),PGC-1基因mRNA表达下调(P<0.05),dTOR基因 mRNA 表达上调(P<0.01),Col a 基因 mRNA表达上调(P<0.01),bmm基因mRNA表达下调(P<0.01),dFAS基因mRNA表达上调(P<0.01),dFAS/bmm表达比值增加。与正常表达组相比,dSir2突变组心脏Nmnat基因mRNA表达量略有下调(P>0.05),dSir2基因mRNA表达下调(P<0.01),dFoxo基因mRNA表达下调(P<0.01),PGC-1基因mRNA表达下调(P<0.05),dTOR基因mRNA表达上调(P<0.01),Col4al基因mRNA表达上调(P<0.01),bmm基因mRNA表达下调(P<0.01),dFAS基因mRNA表达下调(P<0.01),dFA,S/bmm表达比值增加。与正常表达组相比,dSir2-过表达组果蝇心脏Nmnat基因mRNA表达上调(P<0.01),dSir2基因mRNA表达上调(P<0.01),dFoxo基因mRNA表达上调(P<0.01),PGC-1基因mRNA表达上调(P<0.01),dTO 基因mRNA表达下调(P<0.01),Col4al基因mRNA表达下调(P<0.01),bmm基因mRNA表达上调(P<0.01),dFAS基因mRNA表达下调(P<0.01),dFA,S/bmm表达比值减少。与正常表达组相比,Nmnat-RNAi组果蝇心脏Nmnat基因表达下调(P<0.05),dSir2基因表达量下调(P<0.05),dFoxo基因mRNA表达下调(P<0.05),PGC-1 基因 mRNA 表达下调(P<0.01),dTOR基因mRNA表达上调(P<0.01),Col4al基因mRNA表达上调(P<0.05),bmm基因mRNA表达下调(P<0.01),dFAS基因表达量无明显变化(P>0.05),dFAS/bmm表达比值增加。与正常表达组相比,iNmnat-过表达组果蝇心脏Nmnat基因mRNA表达上调(P<0.01),dSir2基因mRNA表达上调(P<0.01),dFoxo基因mRNA表达上调(P<0.01),PGC-1基因mRNA表达上调(P<0.01),dTOR基因表达量表达量无明显变化(P>0.05),Col4al基因mRNA表达下调(P<0.01),bmm基因mRNA表达上调(P<0.01),dFAS基因mRNA表达上调(P<0.01),dFAS/bmm表达比值减少。3.3规律攀爬运动对5周龄果蝇心脏dSir2和Nmnat基因敲减或突变诱发的心脏脂质毒性损伤和心脏NAD+-dSir2/Nmnat通路的影响3.3.1 M-mode检测果蝇心脏功能结果与dSir2-RNAi安静组相比,dSir2-RNAi运动组心率降低(P<0.01),缩短分数增加(P<0.01),心律不齐指数降低(P<0.01),心脏纤维性振降低(P<0.01)。与dSir突变安静组相比,dSir2突变运动组心率降低(P<0.01),缩短分数增加(P<0.05),心律不齐指数降低(P<0.05),纤维性振降低(P<0.01)。与Nmnat-RNAi安静组相比,Nmnat-RNAi运动组心率降低(P<0.01),缩短分数增加(P<0.05),心律不齐指数降低(P<0.05),纤维性振降低(P<0.01)。3.3.2 ELISA检测果蝇心脏各指标结果与dSir2-RNAi安静组相比,dSir2-RNAi运动组心脏TAG水平降低(P<0.01),NAD+水平增加(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平增加(P<0.01),SOD活力水平增加(P<0.01),MDA水平降低(P<0.01)。与dSir2突变安静组相比,dSir2突变运动组心脏TAG水平降低(P<0.01),NAD+水平增加(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平增加(P<0.01),SOD活力水平增加(P<0.01),MDA水平降低(P<0.01)。与Nmnat-RNAi安静组相比,Nmnat-RNAi运动组心脏TAG水平降低(P<1.01),NAD+水平增加(P<0.01),dSIR2去乙酰化水平增加(P<0.01),SOD活力水平增加(P<0.01),MDA水平降低(P<0.01)。3.3.3 qRT-PCR检测果蝇心脏相关基因表达结果与dSir2-RNAi安静组相比,dSir2-RNAi运动组Nmnat基因表达上调(P<0.01),dSir2基因表达上调(P<0.01),dFoxo基因表达上调(P<0.01),PGC-1基因表达上调(P<0.01),bmm基因表达上调(P<0.01),dFAS基因表达下调(P<0.01),dTOR基因表达下调(P<0.01),Col4a1基因表达下调(P<0.01),dFAS/bmm表达比值减少。与dSir2突变安静组相比,dSir2突变运动组Nmnat基因表达上调(P<0.01),dSir2基因表达上调(P<0.01),dFoxo基因表达量无明显变化(P>0.05),PGC-1基因表达上调(P<0.01),bmm基因表达上调(P<0.01),dFAS基因表达上调(P<0.01),dTOR基因表达下调(P<0.01),Col4al基因表达下调(P<0.01),dFAS/bmm表达比值减少。与Nmnat-RNAi安静组相比,Nmnat-RNAi运动组Nmnat基因表达上调(P<P<01),dSir2基因表达上调(P<0.01),dFoxo基因表达上调(P<0.05),PGC-1基因表达上调(P<0.05),bmm基因表达上调(P<0.01),dFAS基因表达上调(P<0.01),dTOR基因表达下调(P<0.05),Col4al基因表达下调(P<0.05),dFAS/bmm表达比值减少。4结论4.1高脂膳食可诱发果蝇心肌脂质毒性损伤。包括使心脏脂质堆积和氧化应激增加,心肌细胞结构异常改变,包括肌原纤维排列紊乱以及心肌线粒体数量减少和形态异常,并使心脏节律紊乱,收缩能力减弱,舒张功能障碍,心律不齐和纤维性振颤风险增加。其分子机制与高脂膳食能抑制果蝇心脏NAD+-dSir2/Nmnat信号通路活性,以及上调dtO R、Col4al表达、dFAS与bmm表达比值有关。4.2果蝇规律攀爬运动能增强心脏功能,降低心肌脂质毒性损伤发生风险,其分子机制与规律运动能良性调节果蝇心脏NAD+-dSir2/Nmnat信号通路相关因子活性,以及dTOR、Col4al表达、dFAS与bmm表达比值有关。4.3果蝇心脏基因Nmnat和dSir2作为NAD+-dSir2/Nnat信号通路关键因子,对心肌脂质毒性损伤有重要调控作用。适当过表达Nmnat和dSir2,基因能激活NAD+-dSir2/Nmnat通路能抵抗高脂膳食诱发心肌脂质毒性损伤;敲减或突变则抑制NAD+-dSir2/Nmnat通路并诱发心肌脂质毒性损伤。且NAD+-Sir2/Nmnat通路参与心脏dTOR、Col4al表达、dFA与bmm表达比值的调节。4.4果蝇规律攀爬运动不仅能抵抗高脂膳食诱发心肌脂质毒性损伤,还能改善心脏基因Nmnat和dSir2敲减或突变诱发的心肌脂质毒性损伤,其机制在于规律运动能良性调节果蝇心脏NAD+-dSir2/Nmnat信号通路。提示果蝇心脏NAD+-dSir2/Nmnat信号通路是介导规律运动抵抗和改善心肌脂质毒性损伤重要通路。