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研究背景脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)发生于多种眼部疾病,如年龄相关性黄斑变性(AMD)、眼组织胞浆菌病(OHS)、病理性近视和眼外伤等,是年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)导致视力丧失的最主要的原因之一,其发病机制至今尚不十分清楚。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞可以通过调节自身多种基因的表达,对缺氧和代谢变化等周围环境的刺激产生快速的应答。在CNV发生的启始阶段,RPE细胞分泌细胞因子和生长因子,促进CNV的生成。CNV的发生机制十分复杂,受到生长因子和细胞黏附信号等多种因素的影响,缺血缺氧可能是CNV形成重要的始动因素。局部微环境的改变可致脉络膜毛细血管闭塞、萎缩以及纤维化等引起脉络膜供血不足,因而视网膜缺血缺氧,刺激视网膜色素上皮(RPE)细胞分裂和增生,并分泌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等多种细胞因子,导致脉络膜毛细血管向外层视网膜代偿性生长,最后形成CNV。VEGF是迄今为止发现的作用最强的促血管形成因子,也是重要的促细胞分裂素,缺氧可上调其表达。RPE细胞是CNV中主要的细胞成分,缺氧诱导RPE细胞表达VEGF可能是CNV发生的关键环节。近来研究表明,转录因子Sp1与VEGF启动子特异性结合是VEGF转录调控的重要机制。另有研究表明Sp1参与了新生血管的应答,并且在肿瘤新生血管发生中发挥重要的调控作用。然而,Sp1在CNV发生中的作用尚未见相关报道。目的(1)观察激光诱导的大鼠CNV形成早期Sp1的表达和定位;(2)建立体外培养的人RPE细胞化学缺氧模型,观察缺氧状态下RPE细胞Sp1的表达;(3)运用Sp1特异性抑制剂Mithramycin A研究Sp1信号转导通路对缺氧诱导的体外培养的人RPE细胞增生以及VEGF表达的影响。方法(1)建立激光诱导的BN大鼠CNV模型,以免疫荧光法观察CNV生成早期Sp1的定位;(2)利用COCL2建立RPE细胞化学缺氧模型。采用RT-PCR和Western blot方法观察Sp1表达水平的变化,免疫荧光法观察RPE细胞内Sp1定位的改变;(3)用200nMSp1抑制剂MithramycinA处理RPE细胞,在缺氧条件下分别培养2、4、8、12和24h,用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测Sp1信号通路阻断前后缺氧RPE细胞的增生指数,以RT-PCR方法观察VEGF mRNA表达,ELISA检测人RPE细胞上清中VEGF的含量。结果(1)在激光诱导的大鼠CNV生成第3d,即可见Sp1高表达于CNV区域,且主要定位于参与CNV生成的增生移行的RPE细胞中;(2) RT-PCR和Western blot显示,正常培养的人RPE细胞内Sp1 mRNA和蛋白表达量微弱。随缺氧时间的延长,Sp1表达量逐渐增强,至12h达到峰值,24h开始下降,但仍高于常氧状态;免疫荧光显微镜观察,常氧状态下,Sp1蛋白荧光主要分布于RPE细胞胞质内。缺氧后,细胞质内绿色荧光强度减弱,细胞核荧光强度明显增强;(3) FCM检测MithramycinA处理组细胞增生指数明显低于对照组(P<0.05);随缺氧时间的增加,RT-PCR显示VEGF mRNA表达逐渐增强,至12h达峰值;MithramycinA处理组较对照组中VEGF mRNA的表达受到明显抑制;ELISA检测证实,缺氧条件下培养的人RPE细胞上清液中VEGF含量随时间逐渐增加,而MithramycinA处理组RPE细胞条件培养液中VEGF含量显著低于对照组(P<0.05)。结论(1)RPE细胞内Sp1可能参与了激光诱导的大鼠CNV早期的发生过程;(2)缺氧可诱导人PRE细胞内Sp1的高表达;(3) Sp1参与调控了缺氧诱导的人RPE细胞VEGF的高表达。