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类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病,可造成全身性的炎症和骨质流失。破骨细胞是唯一具备骨重吸收功能的多核细胞,在RA中被过度刺激分化并活化,导致严重的骨破坏。骨吸收是一个复杂的过程,粘附于骨表面的破骨细胞首先通过骨架重排形成封闭吸收区,隔绝骨质;并通过皱褶缘主动分泌H+,释放水解酶如MMP9,营造酸性环境,降解矿质和骨基质;通过胞吞作用,转移并清除降解产物。囊泡转运过程在破骨细胞的分化及骨吸收功能中至关重要,而这一过程对能量供给具有高度依赖性。破骨细胞是一种具丰富线粒体表达的细胞,线粒体相关蛋白表达异常对其影响显著。ATP5B基因负责编码线粒体ATP合成酶β亚基,是ATP合成的催化核心。我们发现,在成熟的破骨细胞中,ATP5B的表达异常升高,提示其可能在破骨细胞的分化活化过程中扮演着重要角色。本次研究,我们证实干预ATP5B可明显降低破骨细胞线粒体功能,从而抑制其骨吸收活性,保护RA小鼠模型中的关节骨质。研究目的:探究ATP5B在破骨细胞分化及骨吸收功能中的作用及其对胶原诱导型关节炎小鼠骨侵蚀的影响。实验方法:1、以慢病毒感染的方式敲低原代小鼠骨髓单核细胞中ATP5B的表达,并诱导其向破骨细胞分化;TRAP染色及骨吸收陷窝实验探究ATP5B对破骨细胞生成及骨吸收的影响;RT-qPCR和Western blot检测破骨细胞相关标志基因及黏附相关蛋白的表达;免疫荧光染色观察破骨细胞封闭吸收区形成情况;吖啶橙染色检测细胞泌酸功能;明胶酶谱法检测MMP9的分泌及活性。2、为研究干扰ATP5B对线粒体功能的影响,采用试剂盒检测细胞内ATP含量和ROS水平,RT-qPCR检测线粒体生物合成相关基因的表达。利用一种ATPase抑制剂,探究阻断能量供给对破骨细胞相关标志基因表达的影响。3、建立胶原诱导型关节炎小鼠模型,通过关节局部注射慢病毒的方式,敲低ATP5B的表达。观察记录炎症评分,Micro-CT和HE染色评估关节发病和骨质破坏情况;ELISA检测血清中炎症因子的水平及组织中CTX-I的含量;RT-qPCR和Western blot检测关节组织中破骨细胞相关基因及蛋白的表达。实验结果:1、在体外,成功建立细胞内ATP5B敲低方法;敲低ATP5B后明显降低破骨细胞相关基因的表达;减弱破骨细胞肌动蛋白环所形成的封闭吸收区,Integrinβ3及粘附相关分子p-FAK/p-Src表达下降;V-ATPase合成减少,泌酸能力减弱;MMP9的分泌活性降低,显著抑制破骨细胞分化及骨吸收活性。2、敲低ATP5B后,细胞内ATP含量减少;ROS水平升高,细胞自噬增强;PGC-1α、NRF-1/2、TFAM 基因的表达下降;5μM 及 10μM 的 Oligomycin A 可明显下调破骨细胞相关标志基因的表达。3、成功建立CIA模型并进行踝关节局部干扰ATP5B的表达,敲低ATP5B降低了 CIA小鼠炎症评分,显著保护关节骨质;下调关节组织TRAP、CtsK、MMP9、Integrin β3、NFATc1 基因的表达,抑制了 V-ATPase、MMP9、Integrin β3、p-FAK/p-Src蛋白的表达,降低了组织中CTX-1的含量;但并未影响血清中IL-1β、TNF-α 及 IgG2α 的含量。实验结论:1、敲低ATP5B抑制破骨细胞的分化及活化,阻碍封闭区的形成,减少H+及MMP9的分泌从而抑制骨吸收活性。2、敲低ATP5B影响线粒体性能稳定,抑制线粒体生物合成,阻碍破骨细胞的能量供给,引起骨吸收功能障碍。3、关节局部敲低ATP5B抑制关节组织破骨细胞的分化、活化,显著保护CIA小鼠的骨质,但对机体的炎症水平无明显影响。